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    雞蛋中氟苯尼考質(zhì)控樣品的研制及穩(wěn)定性評價

    2022-06-02 08:43:14蔡若純鄧皇翼劉耀慧劉鵬展羅志浩劉海虹
    食品科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:氟苯尼凍干雞蛋

    蔡若純,鄧皇翼,劉耀慧,劉鵬展,羅志浩,劉海虹,雷 毅

    (廣東省食品檢驗所,廣東 廣州 510435)

    氟苯尼考又稱氟甲砜霉素,是新一代氯霉素類動物專用抗生素,具有抗菌譜廣、毒副作用小等特點(diǎn),是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的動物專用抗菌藥,被廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖業(yè)[1-2]。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[3]規(guī)定了不同動物種類的氟苯尼考獸藥最大殘留限量,其中產(chǎn)蛋期禁止使用氟苯尼考。國家食品藥品監(jiān)督管理局也對氟苯尼考做出風(fēng)險提示,成人(以60 kg計算)每日從飲食中攝取 0~180 μg的氟苯尼考,正常情況下不會有風(fēng)險,但長期食用氟苯尼考?xì)埩舫瑯?biāo)的雞蛋,對人體健康會產(chǎn)生一定危害[4]。

    目前氟苯尼考的實驗室檢測方法主要有氣相色譜法[5-7]、高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[10-13],檢出限范圍為0.1~1.0 μg/kg。由于獸藥殘留大部分為痕量檢測,在日常檢測及方法確認(rèn)過程中,常采用加標(biāo)回收和基體標(biāo)準(zhǔn)樣品等質(zhì)控手段進(jìn)行質(zhì)量控制[14-15],但加標(biāo)回收難以反映出真正陽性樣品的提取效率,而現(xiàn)有基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的價格昂貴、基質(zhì)品種有限,未能滿足實際工作需求。此外,隨著食品快速檢測方法的發(fā)展,因快速檢測產(chǎn)品具有操作簡便、成本低、檢測周期短等特點(diǎn),快速檢測方法和技術(shù)逐漸廣泛應(yīng)用于氟苯尼考獸藥殘留的現(xiàn)場篩查[16-18]。在快速檢測產(chǎn)品[19]和快檢方法評價[20]驗證過程中往往需要自制特定項目、基質(zhì)和濃度的質(zhì)控樣品,對快速檢測產(chǎn)品性能指標(biāo)和快速檢測整體過程進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究從日常快速檢測和實驗室檢測的不同需求出發(fā),最終設(shè)置0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個添加量,提供一種雞蛋中氟苯尼考質(zhì)控樣品研制方法,彌補(bǔ)有證的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)卻可選項目少、濃度水平單一、采購成本高、定制周期長等問題,同時探究影響氟苯尼考質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的因素,自主研制均穩(wěn)性良好的質(zhì)控樣品可推廣應(yīng)用于快速檢測及實驗室檢測等不同領(lǐng)域。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    雞蛋 市購;氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(99.82%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;正己烷、丙酮(均為分析純)廣州化學(xué)試劑廠;正丙醇(分析純) 天津市永大化學(xué)試劑有限公司 ;乙腈(色譜純) 德國Merck公司;實驗用水均為超純水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T Q-S 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Waters公司;GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司;Scientz 50F/A真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;EFAA-HM-01多孔渦旋振蕩器 上海ANPEL科技股份有限公司;Multifuge X3R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司;HBE-12B固相萃取裝置 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;Milli-Q 超純水制備儀德國Merck公司;國產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)試驗篩(40 目)。

    1.3 方法

    1.3.1 基質(zhì)的選擇與準(zhǔn)備

    采用GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》[21]對樣品中氟苯尼考的含量進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果數(shù)值低于方法檢出限,則選擇作為制備質(zhì)控樣品的空白基質(zhì)。

    1.3.2 方法回收率

    為確保儀器檢測質(zhì)控樣品均勻性和穩(wěn)定性結(jié)果的科學(xué)性,在開展質(zhì)控樣品制備之前先驗證雞蛋中氟苯尼考添加回收率[22-23]。選取不含氟苯尼考的雞蛋為空白基質(zhì),預(yù)處理勻漿后制成雞蛋液,根據(jù)快檢產(chǎn)品及快檢方法評價技術(shù)規(guī)范相關(guān)要求質(zhì)控樣品以1~2 倍氟苯尼考快檢方法或產(chǎn)品檢出限為典型含量水平,同時為更好應(yīng)用于實驗室氟苯尼考檢測的質(zhì)量控制,質(zhì)控樣品充分考慮滿足不同檢測方法的雞蛋氟苯尼考檢出限范圍為0.1~1.0 μg/kg,氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加量為0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平,采用GB/T 22338—2008的方法檢測其含量,并計算回收率。

    1.3.3 質(zhì)控樣品的制備

    以不含氟苯尼考的雞蛋液為空白基質(zhì),添加一定的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),添加量為0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平,4 000 r/min均質(zhì)混勻2 min(采用20 s間歇式攪拌,攪拌6 次)制備成氟苯尼考陽性新鮮質(zhì)控樣品(非凍干組),將新鮮質(zhì)控樣品經(jīng)過24 h冷凍干澡、2 次混勻(4 000 r/min均質(zhì)混勻2 min)、過40 目試樣篩及分裝等步驟,制備成氟苯尼考陽性凍干質(zhì)控樣品(凍干組),具體制備流程如圖1所示。

    圖1 雞蛋中氟苯尼考質(zhì)控樣品的制備流程Fig.1 Preparation process of quality control samples for determination of florfenicol in eggs

    1.3.4 質(zhì)控樣品中氟苯尼考的檢測

    準(zhǔn)確稱取一定量的新鮮陽性質(zhì)控樣品或凍干陽性質(zhì)控樣品(其中凍干樣品按照1∶4比例加蒸餾水復(fù)溶,渦漩混勻恢復(fù)至蛋液狀態(tài)),采用GB/T 22338—2008方法進(jìn)行測定,凍干樣品結(jié)果以復(fù)溶后樣品質(zhì)量計算,保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。

    液相色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(180 mm×2.1 mm,3.5 μm);流動相:A為水,B為乙腈;梯度洗脫程序:0~1.0 min,90% A、10% B;1.0~3.5 min,90%~10% A、10%~90% B;3.5~4.5 min,10% A、90% B;4.5~4.6 min,10%~90% A、90%~10% B;4.6~6.0 min,90% A、10% B。流速0.35 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積1 μL。

    質(zhì)譜條件:電噴霧離子源;負(fù)離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測模式;電噴霧電壓3.5 kV;離子源溫度500 ℃;碰撞氣為氬氣;干燥氣為氮?dú)?;流? 000 L/h。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

    表1 氟苯尼考的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for determination of folrfenicol

    1.3.5 質(zhì)控樣品的均勻性評估

    依據(jù)CNAS-GL003:2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[24]和RB/T 031—2020《能力驗證計劃的選擇與核查及結(jié)果利用指南》[25]要求,隨機(jī)稱取上述凍干組(固態(tài))和非凍干組(液態(tài))氟苯尼考質(zhì)控樣品各10 份(n=10),每份樣品重復(fù)測定2 次,并采用單因子方差分析法計算F值,進(jìn)行均勻性評估分析。若計算得到的方差分析F<F0.05(9,10),則判定樣品均勻性良好。

    1.3.6 質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性

    1.3.6.1 短期穩(wěn)定性

    參照CNAS-GL003:2018,每隔1 個月隨機(jī)抽取6 個樣品(n=6),采用獨(dú)立樣本t檢驗法,與均勻性檢驗數(shù)據(jù)的初始值進(jìn)行比較分析,從而監(jiān)測不同制備方式、貯存溫度、加標(biāo)量條件下樣品中氟苯尼考含量變化,考察各條件對短期穩(wěn)定性的影響。

    將上述凍干組和非凍干組質(zhì)控樣品置于-18 ℃貯存,考察不同樣品狀態(tài)對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。

    將凍干組質(zhì)控樣品分別置于25、4、-18 ℃貯存,考察不同貯存溫度對凍干質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。

    將3 個添加量的凍干組質(zhì)控樣品置于-18 ℃貯存,考察不同加標(biāo)量對凍干質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。

    1.3.6.2 長期穩(wěn)定性

    長期穩(wěn)定性研究12 個月,每隔3 個月時間隨機(jī)抽取6 個樣品,平行測定2 次取平均值,采用t檢驗法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    1.3.7 質(zhì)控樣品的定值

    參照CNAS-CL04:2007《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則》[26]和JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》[27]。本研究選取凍干質(zhì)控樣品為例,采用6 家中國合格評定國家認(rèn)可委員會認(rèn)可的實驗室進(jìn)行聯(lián)合定值的方式,給每個實驗室發(fā)放3 份質(zhì)控樣品,每個樣品測定2 次平行,采用實驗室認(rèn)可的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法分別測定氟苯尼考含量,通過吉布斯G檢驗和科克倫C檢驗判定檢測結(jié)果無異常值后,最終將測定的總平均值作為質(zhì)控樣品的參考值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 添加回收率結(jié)果

    選取經(jīng)GB/T 22338—2008方法確證不含有氟苯尼考的雞蛋作為空白基質(zhì),分別添加0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平的目標(biāo)物,驗證雞蛋中氟苯尼考回收率。經(jīng)儀器測定結(jié)果表明本方法添加氟苯尼考回收率在85.8%~113.7%之間(表2),符合GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》[28]方法回收率偏差范圍相關(guān)要求,表明儀器檢測方法準(zhǔn)確、可靠。

    表2 雞蛋中氟苯尼考回收率Table 2 Recoveries of florfenicol spiked in eggs

    2.2 氟苯尼考質(zhì)控樣品的均勻性

    采用GB/T 22338—2008方法分別測定非凍干組(A)和凍干組(B)質(zhì)控樣品3 個添加量的氟苯尼考含量,測量結(jié)果采用單因子方差統(tǒng)計分析法(F檢驗)分析處理,SPSS軟件分析實驗結(jié)果的F值,結(jié)果見表3和表4。

    表3 非凍干組(A)質(zhì)控樣品均勻性檢驗結(jié)果Table 3 Results of homogeneity test for non-lyophilized samples (A)

    續(xù)表3

    表4 非凍干組(B)質(zhì)控樣品均勻性檢驗結(jié)果Table 4 Results of homogeneity test for non-lyophilize samples (B)

    實驗測試的組內(nèi)自由度為10,組間自由度為9,經(jīng)統(tǒng)計分析,非凍干組(A)3 個水平的F值在2.562~2.914之間,凍干組(B)3 個添加量的F值在1.970~2.804之間,均小于臨界值F0.05(9,10)=3.020,P值均大于0.05,表明在顯著水平α=0.05時,添加同一添加量的樣品之間不存在顯著性差異,添加的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在雞蛋基質(zhì)中均勻分散,均勻性驗證方差分析結(jié)果見表5。

    表5 均勻性驗證方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis

    2.3 氟苯尼考質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性

    2.3.1 短期穩(wěn)定性

    2.3.1.1 樣品狀態(tài)對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響

    制備分裝完成的非凍干組(液態(tài))和凍干組(固態(tài))質(zhì)控樣品分別置于-18 ℃貯存,每隔1 周檢測1 次,每組測定6 個樣品,檢測平均值即為質(zhì)控樣品氟苯尼考含量,監(jiān)測3 個月內(nèi)2 組質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量變化。從圖2可以看出,凍干質(zhì)控樣品較非凍干質(zhì)控樣品含量變化趨勢更平緩。按CNAS-GL003:2018穩(wěn)定性檢驗要求,將每次檢測平均值與初始檢測平均值進(jìn)行一致性比較,計算t值,其中凍干質(zhì)控樣品第1個月至第3個月的t值在0.802~1.641之間,均小于t臨界值(2.145)。非凍干質(zhì)控樣品第1個月至第3個月的t值在2.786~7.472之間,第3個月t值大于t臨界值(2.145)。結(jié)果表明凍干質(zhì)控樣品較非凍干質(zhì)控樣品在-18 ℃條件貯存3 個月的短期穩(wěn)定性更高。

    圖2 樣品狀態(tài)對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響Fig.2 Impact of sample state on the stability of quality control samples

    凍干質(zhì)控樣品基本不含水分,在-18 ℃貯存條件下雞蛋的蛋白質(zhì)不易發(fā)生不可逆變性,因此其抗凍性和穩(wěn)定性較強(qiáng)。目前已有相關(guān)研究表明雞蛋主要成分卵白蛋白經(jīng)過冷凍干燥后,結(jié)構(gòu)上并未發(fā)生斷裂和重組,并且化學(xué)性質(zhì)均未發(fā)生明顯變化,說明冷凍干燥處理不會對雞蛋中蛋白質(zhì)產(chǎn)生較大影響[29-30]。與凍干組相比,非凍干組樣品在冷凍過程中容易產(chǎn)生蛋白質(zhì)變性,使與蛋白質(zhì)結(jié)合的氟苯尼考狀態(tài)受到一定程度的影響,此外蛋白質(zhì)不可逆變性產(chǎn)生的絮狀物分層也影響了樣品基質(zhì)的分散性和穩(wěn)定性,從而導(dǎo)致非凍干組質(zhì)控樣品穩(wěn)定性降低。綜上,分析原因可能是凍干組樣品抗凍能力強(qiáng),蛋白質(zhì)不易變性使其具有更高的穩(wěn)定性。

    2.3.1.2 貯存溫度對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響

    凍干質(zhì)控樣品不容易變質(zhì),可以在不同條件下貯存,日常檢驗工作應(yīng)用也更為廣泛,因此本研究以凍干質(zhì)控樣品為對象,探究溫度條件對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響。將制備分裝完成的凍干質(zhì)控樣品分組放置于25、4、-18 ℃貯存,監(jiān)測3 個月內(nèi)不同溫度貯存的質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量變化,由圖3可以看出,-18 ℃組質(zhì)控樣品氟苯尼考含量變化趨于平緩,25 ℃組和4 ℃組質(zhì)控樣品氟苯尼考含量在第3個月有明顯下降。

    圖3 不同貯存溫度對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響Fig.3 Impact of storage temperature on the stability of quality control samples

    經(jīng)t檢驗,凍干質(zhì)控樣品在-1 8 ℃條件貯存1~3 個月的t值范圍在0.802~1.641之間,均小于t臨界值(2.145)。在25 ℃條件下貯存1~3 個月的t值在0.458~8.501之間,第3個月t值為8.501,大于t臨界值(2.145)。在4 ℃條件下貯存1~3 個月的t值在1.053~4.845之間,其中第3個月t值為4.845,大于t臨界值(2.145)。上述結(jié)果表明質(zhì)控樣品在-18 ℃條件下貯存3 個月的短期穩(wěn)定性良好,且較4 ℃和25 ℃條件貯存更為穩(wěn)定。分析原因可能是受微生物繁殖的影響,由于質(zhì)控樣品制備過程未進(jìn)行滅菌處理,樣品存在有一定基數(shù)的微生物,其中雞蛋中主要的微生物種群為沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等,其最適生長溫度在20~40 ℃之間,在25 ℃(常溫)條件貯存微生物生長繁殖最快,所以添加的抗生素在微生物作用下迅速降解。而貯存溫度降低則會明顯減緩微生物的生長繁殖,從而降低氟苯尼考的消耗和降解速率,故在-18 ℃(冷凍)條件下貯存的質(zhì)控樣品氟苯尼考含量變化趨勢平緩。目前已有研究表明微生物對氟苯尼考等抗生素的降解起主導(dǎo)作用[31-32],這說明貯存溫度對氟苯尼考質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響可能主要來自對微生物繁殖的影響。

    2.3.1.3 加標(biāo)量水平對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性的影響

    將不同添加量的凍干質(zhì)控樣品置于-18 ℃貯存,監(jiān)測3 個月內(nèi)不同添加量的質(zhì)控樣品氟苯尼考含量變化,由圖4可以看出不同添加量(0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg)的質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量變化趨勢均較為平緩。經(jīng)t檢驗,0.25 μg/kg的質(zhì)控樣品穩(wěn)定性檢驗t值在0.684~1.932之間,0.4 μg/kg的t值在0.437~1.689之間,2.0 μg/kg的t值在0.802~1.641之間,均小于t臨界值(2.145)。上述結(jié)果表明不同濃度質(zhì)控樣品在-18 ℃條件下貯存3 個月的短期穩(wěn)定性良好。

    2.3.2 長期穩(wěn)定性

    將不同含量分裝好的凍干質(zhì)控樣品貯存于-18 ℃,放置12 個月,期間每間隔3 個月隨機(jī)抽取6 份進(jìn)行測定,監(jiān)測該質(zhì)控樣品長期穩(wěn)定性,所有t值均小于t臨界值(2.145),結(jié)果見表6。結(jié)果表明不同添加量的質(zhì)控樣品在12 個月存儲期間,穩(wěn)定性良好。

    表6 質(zhì)控樣品的長期穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 6 Results of long-term stability test for quality control samples

    2.4 質(zhì)控樣品的定值

    本研究按照自主研制3 個添加量的氟苯尼考質(zhì)控樣品,經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性驗證結(jié)果滿足CNAS-GL003:2018相關(guān)要求,以凍干質(zhì)控樣品(固態(tài))為例,選取6 家CNAS認(rèn)證的實驗室,采用GB/T 22338—2008標(biāo)準(zhǔn)方法檢測凍干質(zhì)控樣品目標(biāo)物含量,分別匯總各組參加合作定值數(shù)據(jù),結(jié)果見表7。

    表7 質(zhì)控樣品的定值數(shù)據(jù)及結(jié)果Table 7 Analytical results for certification of quality control samples

    通過吉布斯檢驗,發(fā)現(xiàn)所有實驗數(shù)據(jù)G值均不大于G0.05臨界值(查表得1.89),表明數(shù)據(jù)不存在異常值,再通過用科克倫檢驗確定6 個實驗室對不同添加量質(zhì)控樣品的檢測數(shù)據(jù)C值不大于C0.05(6,6)臨界值(查表得0.445),表明沒有隨機(jī)誤差太大的實驗室,各實驗室間的測量屬于等精度測量,因此將所有實驗室每個添加量質(zhì)控樣品的總平均值作為氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)樣品含量定值結(jié)果:X1=0.23 μg/kg,X2=0.39 μg/kg,X3=1.92 μg/kg,3 個添加量的質(zhì)控樣品可應(yīng)用于快速檢測或?qū)嶒炇覚z測的質(zhì)量控制及能力驗證等領(lǐng)域。

    3 結(jié)論

    采用雞蛋基質(zhì)分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式成功研制了3 個添加量的液態(tài)質(zhì)控樣品,另外將液態(tài)樣品采用真空冷凍干燥的方式,制得固態(tài)凍干粉,2 種狀態(tài)質(zhì)控樣品均勻性均較良好。通過考察3 個月短期穩(wěn)定性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品狀態(tài)、不同貯存溫度對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性有影響,不同的添加量則對質(zhì)控樣品穩(wěn)定性無影響。該方法制備的凍干質(zhì)控樣品比非凍干質(zhì)控樣品穩(wěn)定性更高,分析原因可能是凍干組抗凍性能更好,蛋白質(zhì)不易變性使其具有更高的穩(wěn)定性。為了保證質(zhì)控樣品穩(wěn)定性,建議采用冷凍干燥方式去除水分。凍干質(zhì)控樣品在冷凍(-18 ℃)貯存12 個月穩(wěn)定性良好,但在冷藏(4 ℃)和常溫(25 ℃)貯存3 個月穩(wěn)定性有所下降,可能是受微生物繁殖的影響,貯存溫度降低會明顯減緩微生物的生長繁殖,從而降低氟苯尼考的消耗和降解速率。本研究制備的凍干質(zhì)控樣品不易變質(zhì),冷凍條件下可穩(wěn)定保存12 個月,可應(yīng)用于實驗室日常檢測作為質(zhì)量控制手段,并推廣應(yīng)用于快檢產(chǎn)品評價、快檢機(jī)構(gòu)考核、快檢方法研制等快檢各個領(lǐng)域。

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