芭蕉根促成骨細(xì)胞增殖及分化的有效組分篩選研究

董莉 許敏 陳華娟 郭婷 董永喜

[摘要] 目的 對芭蕉根提取物各組分促成骨細(xì)胞增殖及分化的有效組分進(jìn)行篩選。方法 于2018年6月—2019年1月，采用人成骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞，芭蕉根各組分組加入濃度為100 mg/L作用細(xì)胞48 h 后，用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖，酶聯(lián)免疫法（ELISA）法檢測細(xì)胞上清液中堿性磷酸酶（ALP）、鈣離子（Ca2+）和骨鈣素（BGP）的含量。 結(jié)果 與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均可顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖（P<0.05），分別使細(xì)胞增殖16.74%、5.57%、10.02%;升高細(xì)胞中 ALP的含量（P<0.005），分別使細(xì)胞中 ALP的含量增加58.11%、21.45%、39.57%;促進(jìn)細(xì)胞中Ca2+、BGP 的分泌（P<0.01），其中B組分的作用最顯著。 結(jié)論 B組分為芭蕉根促成骨細(xì)胞增殖及分化的有效組分，其可能通過升高ALP、Ca2+的含量、促進(jìn)BGP的分泌從而促成骨細(xì)胞增殖及分化。

[關(guān)鍵詞] 芭蕉根;有效組分;成骨細(xì)胞; 增殖及分化

[中圖分類號] R285 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-0742（2019）06（c）-0013-04

[Abstract] Objective To screen the effective components of the growth and differentiation of bone cells in the extracts of banana root. Methods From June 2018 to January 2019， human osteosarcoma SaOS-2 cells were used. The cells of the banana roots were added to the cells treated with 100 mg/L for 48 h， and then detected by MTT assay. Cell proliferation and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the contents of alkaline phosphatase （ALP）， calcium （Ca2+） and osteocalcin （BGP） in the supernatant. Results Compared with the blank control group， the B， C， and D components significantly promoted cell proliferation （P<0.05）， and the cells proliferated 16.74%， 5.57%， and 10.02%， respectively. The content of ALP （P<0.005） increased the content of ALP in cells by 58.11%， 21.45% and 39.57%， respectively， and promoted the secretion of Ca2+ and BGP in cells （P<0.01）. Most notable in group B. Conclusion Group B of component is an effective component of banana root promoting osteoblast proliferation and differentiation. It may promote osteoblast proliferation and differentiation by increasing the content of ALP and Ca2+ and promoting the secretion of BGP.

[Key words] Banana root; Effective components; Osteoblasts; Proliferation and differentiation

芭蕉根，為芭蕉科植物芭蕉Musa basjoo Sied.et Zucc.的干燥根莖，收載于《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003 年版[1-2]。具有清熱解毒，止渴利尿之功效。用于風(fēng)熱頭痛，水腫腳氣，血淋，肌膚腫痛，丹毒。已收入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的以芭蕉根為原料開發(fā)的制劑品種骨康膠囊、腫痛舒噴霧劑具有滋補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋壯骨，通絡(luò)止痛之功效的功效，用于治療骨質(zhì)疏松、骨折、跌打損傷、瘀血腫痛等癥時療效顯著。有關(guān)芭蕉根促成骨細(xì)胞增殖的研究目前未見報道，因此該實(shí)驗(yàn)于2018年6月—2019年1月選擇人成骨肉瘤細(xì)胞株SaOS-2， 觀察芭蕉根提取物的各個組分對成骨細(xì)胞增殖及分化的影響，篩選芭蕉根促成骨細(xì)胞增殖及分化的有效組分，探討其可能的作用機(jī)制，皆在為臨床應(yīng)用提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 ?資料與方法

1.1 ?一般資料

人成骨肉瘤細(xì)胞SaOS-2，購自中科院上海細(xì)胞庫。芭蕉根藥材經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)中藥標(biāo)本館龍慶德教授鑒定鑒定為芭蕉Musa basjoo Sied.et Zucc.的干燥根莖。

1.2 ?主要試劑

McCOYs 5A 培養(yǎng)基（批號2018-16）;胎牛血清（批號：NZE3158）;噻唑藍(lán)（批號：M8345）;維生素D3注射液（批號：20180361）;堿性磷酸酶試劑盒（批號20180120）;鈣離子試劑盒（批號A038-4）;骨鈣素試劑盒（批號G053-9）。

1.3 ?方法

1.3.1 ?芭蕉根組分的制備 ?芭蕉根500 g，分別加10倍、8倍、8倍70%乙醇回流提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收乙醇并濃縮至浸膏。浸膏加蒸餾水制成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各個萃取液，剩余的水部分回收溶劑，揮干，干燥分別得A、B、C、D組分。

1.3.2 ?細(xì)胞增殖檢測 ?取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞 以1×104個/孔將接種于96孔板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后?？瞻讓φ战M加不含藥培養(yǎng)基，藥物組每孔加入濃度為100 mg/L的各組分100 μL，陽性對照組為含30 mg/L維生素D3的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用噻唑藍(lán)在酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各組吸光度值。

1.3.3 ?ALP含量檢測 ?取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞 以1×105個/孔將接種于24孔板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后?？瞻讓φ战M加不含藥培養(yǎng)基，藥物組每孔加入濃度為100 mg/L的各組分100 μL，陽性對照組為含30 mg/L維生素D3的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明書測定ALP的含量。

1.3.4 ?Ca2+、BGP含量檢測 ?取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞 以1×105個/孔將接種于24孔板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后?？瞻讓φ战M加不含藥培養(yǎng)基，藥物組每孔加入濃度為100 mg/L的各組分100 μL，陽性對照組為含30 mg/L維生素D3的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明書測定Ca2+、BGP的含量。

1.4 ?統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以（x±s）表示， 組間采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?對細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均可顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖（P<0.05），分別使細(xì)胞增殖16.74%、5.57%、10.02%。見表1。

2.2 ?對ALP含量的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均能顯著升高細(xì)胞中 ALP的含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.005），分別增加58.11%、21.45%、39.57%，其中B組分使細(xì)胞中 AL含量升高至（1479.48±45.87）U/g，見表2。

2.3 ?對Ca2+、BGP含量的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均能顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的分泌、升高細(xì)胞中BGP 的含量（P<0.01），其中B組分使細(xì)胞中Ca2+、BGP的含量分別升高至（179.61±16.83）μg/L和（19.15±3.07）μg/L，見表3。

3 ?討論

芭蕉根作為民間常用藥材，用于治療骨質(zhì)疏松、骨折等疾病，在臨床上發(fā)揮了較好的治療作用。芭蕉根含有蒽醌、皂苷、香豆素、多糖、黃酮、揮發(fā)油等化學(xué)成分[3-7]，具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖及α -葡萄糖苷酶抑制等多種藥理活性[8-10]，到目前為止，芭蕉根促成骨細(xì)胞增殖的研究基本上屬于空白。由于物質(zhì)基礎(chǔ)的不明確使得臨床上所有含有芭蕉根的藥物多為復(fù)方。缺乏芭蕉根有效組分/成分的研究，就缺乏對癥用藥的客觀、科學(xué)的依據(jù)，難以保證芭蕉根相關(guān)藥品的臨床藥效，嚴(yán)重制約了芭蕉根在防治骨科方面疾病作用的充分發(fā)揮以及相關(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)。

骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和骨量流失的全身性骨代謝疾病。骨質(zhì)疏松多見于老年人及絕經(jīng)后的婦女，是現(xiàn)今社會面臨的醫(yī)療問題之一。目前的治療藥物主要有降鈣素、雌激素、羅鈣全、鈣制劑等。但大多存在著食欲減退、敏、惡心、頭昏等不良反應(yīng)，且一旦停藥，會導(dǎo)致骨質(zhì)流失速度加快。中草藥抗骨質(zhì)疏松具有獨(dú)特的優(yōu)勢，既有強(qiáng)筋壯骨的、消腫止痛作用，又具備免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，具有遠(yuǎn)期療效好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。因此，從中草藥中研究發(fā)現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)，對抗骨質(zhì)疏松新藥的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和科學(xué)價值。

ALP是成骨細(xì)胞分泌的一種外酶，可以破壞鈣化抑制劑，使得鈣和磷可與膠原分子的膠原氨基酸殘基相結(jié)合，從而加強(qiáng)成骨細(xì)胞的鈣化功能，因此它的表達(dá)是成骨細(xì)胞增殖分化的一個明顯特征[11-15]。因此，該實(shí)驗(yàn)考察了芭蕉根不同組分對SaOS-2細(xì)胞中ALP含量的影響。結(jié)果顯示， 與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均可顯著升高細(xì)胞中 ALP的含量（P <0.005），分別使細(xì)胞中 ALP的含量增加58.11%、21.45%、39.57%。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)第二信使，在成骨細(xì)胞中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，成骨細(xì)胞的活性與成骨細(xì)胞內(nèi)鈣Ca2+濃度呈正相關(guān)，即Ca2+濃度的上升直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化[16-17]。BGP是成骨細(xì)胞分化時所分泌的一種非膠原蛋白質(zhì)， 是成骨細(xì)胞的特異性產(chǎn)物，為人體骨骼所釋放的一種激素， 由49個氨基酸構(gòu)成， 具有維持骨的正常礦化速率的作用，主要反映成骨細(xì)胞功能水平，特別是新形成的成骨細(xì)胞的活動狀態(tài)[18-19]。因此，檢測藥物對Ca2+及BGP的影響可反應(yīng)藥物促成骨細(xì)胞增殖及分化的能力。該研究結(jié)果顯示， 藥物B、C、D組分均能顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的分泌、升高細(xì)胞中BGP 的含量（P<0.01），其中B組分的作用最顯著。

該課題采用溶劑提取法對芭蕉根乙醇粗提取物，并通過水提醇沉和傳統(tǒng)的萃取方法，獲得芭蕉根A、B、C、D不同組分，且各組分通過高效液相色譜分析檢測顯示各個組分化學(xué)成分基本無明顯交叉，表明組分制備合理。該研究結(jié)果顯示B組分升高成骨細(xì)胞中 ALP、Ca2+、BGP含量的作用最顯著，推測芭蕉根B組分促成骨細(xì)胞增殖與分化的作用可能與其所富含的蒽醌、黃酮類化合物有關(guān)，而其有效成分還有待進(jìn)一步的化學(xué)成分分離以及活性研究，以進(jìn)一步闡明芭蕉根治療骨科疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，B組分為芭蕉根促成骨細(xì)胞增殖及分化的有效組分，該結(jié)果提示芭蕉根B組分可能通過升高細(xì)胞內(nèi)ALP、Ca2+的含量、促進(jìn)BGP的分泌從而促成骨細(xì)胞增殖及分化。

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（收稿日期：2019-03-29）