HPLC-MS/MS法測(cè)定安神類(lèi)代用茶中19種鎮(zhèn)靜安神類(lèi)非法添加物質(zhì)

劉國(guó)姣，王彬，曾妮，江豐，*，吳婉琴，王會(huì)霞，郭曉希，張苗

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430075）

隨著生活節(jié)奏的加快，越來(lái)越多的人面臨著失眠的困擾[1-2]。最新調(diào)查顯示，中國(guó)成年人失眠率為38.2%，長(zhǎng)期失眠會(huì)引發(fā)焦慮、抑郁、緊張等情緒，同時(shí)有引發(fā)糖尿病、高血壓等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期失眠的人死亡率更高[3-5]。為了緩解失眠癥狀，一些失眠嚴(yán)重的患者常借助于鎮(zhèn)靜安神類(lèi)藥物來(lái)助眠，但考慮到長(zhǎng)期服用這類(lèi)藥物會(huì)帶來(lái)較大的副作用損害身體健康，現(xiàn)在更多的人傾向于通過(guò)食用一些標(biāo)示有助眠安神功效的天然食品來(lái)減輕癥狀，例如安神類(lèi)代用茶、保健食品等，然而不少?gòu)S商為了增強(qiáng)產(chǎn)品功效，牟取暴利，擅自在鎮(zhèn)靜安神類(lèi)食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)，對(duì)消費(fèi)者健康造成極大威脅。常見(jiàn)的安神類(lèi)非法添加化學(xué)物質(zhì)主要有苯二氮卓類(lèi)（地西泮、氯氮卓、奧沙西泮、三唑侖、硝西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、勞拉西泮、氯硝西泮、咪噠唑侖等）、酚噻嗪類(lèi)、抗組胺類(lèi)（馬來(lái)酸氯苯那敏等）、巴比妥類(lèi)（苯巴比妥、司可巴比妥、巴比妥、異戊巴比妥）等，這些物質(zhì)大部分都是國(guó)家嚴(yán)格監(jiān)管的藥物，若使用不當(dāng)或?yàn)E用將造成嚴(yán)重不良后果，且禁止添加在任何食品中。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)單、高效的分析方法對(duì)安神類(lèi)食品的質(zhì)量安全與相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前普通食品中沒(méi)有針對(duì)鎮(zhèn)靜安神類(lèi)化合物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，只是在鎮(zhèn)靜安神類(lèi)中成藥及改善睡眠類(lèi)保健食品中，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局相繼出臺(tái)了對(duì)應(yīng)的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目的批準(zhǔn)件，批準(zhǔn)件編號(hào)分別為2009024、2012004 和2013002，檢測(cè)項(xiàng)目分別為15 種（分別為地西泮、硝西泮、氯硝西泮、氯氮卓、奧沙西泮、馬來(lái)酸咪噠唑侖、勞拉西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥、氯美扎酮）、4 種（分別為褪黑素、氯苯那敏、佐匹克隆、扎來(lái)普?。┖? 種（分別為羅通定、青藤堿、文拉法辛），檢測(cè)方法均包括薄層色譜法、高效色譜法及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，但不同的批準(zhǔn)件里涉及的提取溶劑、提取方法、液相、液質(zhì)條件各不相同，部分提取方法操作復(fù)雜，缺乏系統(tǒng)性且無(wú)檢出限，給日常食品監(jiān)管帶來(lái)不便。文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定鎮(zhèn)靜安神類(lèi)非法添加物質(zhì)的常見(jiàn)檢測(cè)方法有薄層色譜法[6-8]、液相色譜法[9-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-20]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-24]等。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有定性能力強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，在非法添加物測(cè)定中得到了廣泛應(yīng)用，但有關(guān)安神類(lèi)代用茶中安神類(lèi)非法添加物測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道少見(jiàn)。本試驗(yàn)以19 種非法添加物質(zhì)（褪黑素、氯美扎酮、馬來(lái)酸氯苯那敏、鹽酸文拉法辛、硝西泮、艾司唑侖、氯氮卓、扎來(lái)普隆、氯硝西泮、勞拉西泮、咪噠唑侖、氯氮平、三唑侖、羅通定、阿普唑侖、青藤堿、佐匹克隆、奧沙西泮、地西泮）為研究對(duì)象，建立一種同時(shí)測(cè)定安神類(lèi)代用茶中19 種非法添加物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，本方法快速、靈敏，能滿足高通量測(cè)定食品中多種非法添加物的含量，為政府部門(mén)加強(qiáng)食品質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安神茶樣品：市售，粉碎均質(zhì)后待檢測(cè)。

褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）、馬來(lái)酸氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）、鹽酸文拉法辛標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）、氯硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）、勞拉西泮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）、咪噠唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%）、三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0 %）、羅通定標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0 %）：Dr.Ehrenstorfer 公司；氯美扎酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）、硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%）、艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）、氯氮卓標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%）、氯氮平標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.7%）、阿普唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、青藤堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.0%）、奧沙西泮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）、地西泮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%）：A ChemTek.Inc 公司；佐匹克隆標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、扎來(lái)普隆標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：Toronto Research Chemical 公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；水（色譜純）：Millipore 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

API 4500 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX 公司；UltiMate 3000 高效液相色譜儀：美國(guó)戴安公司；ME2002E/02 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Allegra X-15R 型低速冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Elmasonic S180H 超聲儀：Elma Hans Schmidbaner GmbH&Co.KG 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量的褪黑素、氯美扎酮、馬來(lái)酸氯苯那敏、鹽酸文拉法辛、硝西泮、艾司唑侖、氯氮卓、扎來(lái)普隆、氯硝西泮、勞拉西泮、咪噠唑侖、氯氮平、三唑侖、羅通定、阿普唑侖、青藤堿、佐匹克隆、奧沙西泮、地西泮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，分別配制成0.1 mg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，密封，于4 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液適量，根據(jù)各物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度的不同用甲醇釋至相應(yīng)的濃度范圍的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

精確稱取樣品約1 g（精確到0.001 g）于50 mL 的具塞離心管中，加入25 mL 乙腈，于25 ℃超聲提取20 min，在 4 000 r/min 離心分離 5 min，取上清液 10 mL，用水稀釋至20 mL，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜-質(zhì)譜儀檢測(cè)用。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜分析條件

色譜條件：采用ACE Excel 2 C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流速 0.3 mL/min，流動(dòng)相：A 為 0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇。柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件：正離子模式掃描；離子源：電噴霧離子源（ESI 源）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；氣簾氣（CUR）：35 psi（1 psi=0.006 89 MPa）；霧化器（GS1）：55 psi；輔助氣（GS2）：55 psi；離子源溫度（TEM）：500 ℃。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

表2 19 種非法添加物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Monitored ions，declustering potential and collision energy of 19 kinds of illegal additives

續(xù)表2 19 種非法添加物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Continue table 2 Monitored ions，declustering potential and collision energy of 19 kinds of illegal additives

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2009024、2012004、2013002中流動(dòng)相的條件。本方法比較了甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）分別作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)19 種待測(cè)化合物的色譜分離和質(zhì)譜靈敏度的影響。結(jié)果顯示，選擇甲醇-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸)和乙腈-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相時(shí)各分析物的響應(yīng)比甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)低，且甲醇-0.1%甲酸水比乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)各物質(zhì)間的分離效果更好，且青藤堿的峰形得到改善，因此，本方法選擇甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

2.2 提取溶劑的選擇

根據(jù)19 種目標(biāo)分析物的結(jié)構(gòu)特性和化學(xué)性質(zhì)，本試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、酸化甲醇（含0.1%甲酸），酸化乙腈（含0.1%甲酸）分別作為提取溶劑時(shí)對(duì)19 目標(biāo)分析物提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

如圖1 所示，19 種目標(biāo)分析物均在乙腈作為提取溶劑時(shí)具有更好的提取效果，其中在甲醇和乙腈中加入0.1%甲酸對(duì)各目標(biāo)物的回收率無(wú)明顯影響，因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)回收率的影響Fig.1 Effect of extracted solvents on recovery rate

2.3 方法線性范圍及檢出限

根據(jù)各目標(biāo)分析物響應(yīng)強(qiáng)度的不同，分別吸取一定體積的各目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白樣品的基質(zhì)溶液稀釋，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)物色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明褪黑素、氯美扎酮、青藤堿、奧沙西泮、勞拉西泮、氯氮卓在質(zhì)量濃度為1 ng/mL～100 ng/mL；馬來(lái)酸氯苯那敏、羅通定、硝西泮、地西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、氯硝西泮、扎來(lái)普隆、三唑侖、鹽酸文拉法辛在質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL～50 ng/mL；氯氮平、咪噠唑侖在質(zhì)量濃度為0.2 ng/mL～20 ng/mL；佐匹克隆在質(zhì)量濃度為5 ng/mL～500 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好。根據(jù)以3 倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的濃度作為測(cè)定方法的檢出限，10 倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的濃度作為測(cè)定方法的定量限，得出各目標(biāo)分析物的檢出限和定量限，滿足19 種非法添加物質(zhì)高靈敏度檢測(cè)的需要。

表3 19 種非法添加物質(zhì)的線性范圍、回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，detection limit and quantification limit of 19 kinds of illegal additives

2.4 回收率及精密度試驗(yàn)

為了考察本方法的可行性，在本試驗(yàn)條件下，向安神類(lèi)代用茶空白基質(zhì)中添加低、中、高3 個(gè)水平濃度的19 種安神類(lèi)非法化學(xué)添加物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組添加6 個(gè)平行，回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

續(xù)表4 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Continue table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

續(xù)表4 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Continue table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

由表4 可知，6 次試驗(yàn)結(jié)果的回收率均在80.5%～108.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于 10%。

2.5 安神茶樣品測(cè)定

對(duì)采購(gòu)的20 批次標(biāo)注有安神助眠功能的代用茶按照本研究方法進(jìn)行前處理和分析檢測(cè)，結(jié)果表明，20批次的安神茶中均未檢測(cè)出19 種非法添加物。

3 結(jié)論

本研究基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了快速測(cè)定安神類(lèi)代用茶中褪黑素等19 種非法添加物的檢測(cè)方法，19 種分析物在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于 0.99，該方法的檢出限為 10 μg/kg～200 μg/kg，定量限為 30 μg/kg～600 μg/kg，樣品的回收率為 80.5 %～108.8%。本方法簡(jiǎn)單易行，靈敏度高，是一種高效且低成本的檢測(cè)方法，方法的準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度均滿足日常檢測(cè)要求，可適用于實(shí)驗(yàn)室大批量的代用茶樣品檢測(cè)，為食藥監(jiān)部門(mén)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，保障人民群眾的食品安全。