近紅外光譜建模法快速測定桔子精油中檸檬烯的含量

陳梓云，彭夢俠，阮韻丹

（嘉應學院化學與環(huán)境學院，廣東梅州514015）

柑橘皮通過冷榨法、蒸餾法、冷磨法、溶劑萃取法和超臨界流體萃取法等方法，制得的具有獨特的桔子皮味的精油稱為桔子精油。常用作食品香精、化妝品香精和香水配料，此外，桔子精油清新的氣味及鎮(zhèn)靜效果，有提振精神的作用，常用于平撫沮喪與焦慮；桔子精油可以調和腸胃、也能刺激腸胃蠕動、幫助排氣，還能鎮(zhèn)定消化道，增加胃口、刺激食欲，表現(xiàn)出良好的生理療效[1-2]。決定桔子精油品質的主要成分是檸檬烯，還含有月桂烯、γ-萜品烯、α-蒎烯、佛術烯、芳樟醇、p-薄荷-1（7），2-二烯、香芹醇、a-松油醇等多種化合物[3]。造成桔子精油中主要成分含量差異的因素較多，如提取技術的差異、產地的差異等?？焖儆行У貦z測桔子精油的主要成分的含量，是推動精油市場良好發(fā)展的前提保障。

目前，檢測桔子精油成分的方法是氣相色譜-質譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）[4-6]。檢測時需要對樣品進行前處理，消耗時間較長，因此無法達到快速無損檢測的效果。近年來，近紅外光譜法快速測定含量的研究越來越多，比如：蛹蟲草中腺苷含量的測定[7]、八角茴香中莽草酸含量的測定[8]、羅布麻葉中總黃酮含量的測定[9]、新疆薰衣草精油主要組分的測定[10]、羅紅霉素中兩種主要成分的測定[11]及夏枯草中水溶性浸出物的含量的測定[12]等。

本文采用近紅外光譜法（near infrared spectroscopy，NIR）結合化學計量學方法來建立了桔子精油快速定量的分析方法，能快速、有效地檢測桔子精油中檸檬烯的含量，判別桔子精油的品質，對精油市場的有序發(fā)展具有很重要的現(xiàn)實意義和應用價值[13-16]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備

Antaris II 型傅立葉變換近紅外光譜儀：美國賽默飛公司；GCMS-QP2010 Ultra 型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.2 試劑與樣品

檸檬烯標準溶液（97%）：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。試驗樣品見表1。

表1 試驗樣品Table 1 Experimental sample

2 試驗方法

2.1 GC-MS測定桔子精油中檸檬烯的含量

色譜條件：Rxi-5SilMS 石英毛細管色譜柱；升溫程序：初始溫度50 ℃，以5 ℃/min 升溫至280 ℃并維持2 min；載氣：99.999%He；柱流量 0.95 mL/min，吹掃流量1mL/min，壓力49.5KPa，分流比100∶1；進樣量：1μL。

質譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃；電壓：0.35 kV；質量掃描范圍（m/z）：30～500，間隔 1 sec，掃描速度588，溶劑延遲 3.0 min。

用無水乙醇作溶劑，配制濃度分別為0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mg/L 的檸檬烯標準溶液。以特征離子（檸檬烯）峰面積為縱坐標，檸檬烯濃度為橫坐標，繪制檸檬烯標準工作曲線見如圖1。

圖1 檸檬烯標準工作曲線Fig.1 Limonene standard working curve

該標準曲線的相關系數(shù)R=0.996 8，標準曲線線性關系良好，用于桔子精油中檸檬烯含量的外標法檢測。

稱取適量桔子精油樣品，用無水乙醇稀釋至1 mg/L。在色譜和質譜條件與制作檸檬烯標準曲線時的條件相同的情況下，測定J1～J10 桔子精油樣品。根據(jù)待測樣品桔子精油中檸檬烯的峰面積，即可在外標檸檬烯標準工作曲線上得出桔子精油中檸檬烯的含量。

2.2 桔子精油近紅外光譜的采集

近紅外光譜測定條件：以空氣做背景，采用AntarisⅡ傅立葉近紅外光譜儀的液體透射附件采樣，使用6 mm 光程樣品管，設置波數(shù)范圍10 000 cm-1～4 000 cm-1，掃描次數(shù) 32 次，分辨率 8 cm-1。

取1 mL 桔子精油樣品于液體樣品管中，在同一環(huán)境溫度濕度條件下，以空氣為背景，采集不同種類的桔子精油J1～J10 的近紅外光譜圖。每種桔子精油取5 個樣品，每個樣品測3 張譜圖，每種桔子精油測15 張譜圖。選用RESULT-Integration 軟件、RESULTOperation 軟件采集桔子精油的近紅外譜圖保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 桔子精油中檸檬烯含量的近紅外定量分析模型的建立

在10 種不同的桔子精油樣品的近紅外光譜圖中，各取9 張譜圖，共90 張譜圖為建模校正集樣品譜圖；各選取1 張譜圖，共10 張為驗證集樣品譜圖，進行內部檢驗。將上述100 張譜圖導入TQ Analyst 9.0 軟件，選用偏最小二乘法（partial least square，PLS）建立定量分析模型。光程差設為常數(shù)；尋找最佳的建模光譜范圍及最佳的光譜預處理方式；剔除可疑樣品；優(yōu)化該定量模型。用其校正相關系數(shù)RC、校正均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）；預測相關系數(shù) RP、預測均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）；交互驗證相關系數(shù)RV、交互驗證均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV） 來評估定量模型的優(yōu)劣。

2.4 模型的應用

用2.3 所建模型，檢測10 種桔子精油樣品的檸檬烯含量。將每種桔子精油余下未參與建模的5 張近紅外譜圖，共50 張譜圖作為待測集樣品譜圖，導入模型進行檢測。用各種精油樣品的檸檬烯實際含量（GC-MS測定）與模型預測值之間的相對誤差，對定量分析模型的準確性進行評估。

3 結果與討論

3.1 GC-MS測定桔子精油中檸檬烯含量的結果

用2.1 的方法測得J1～J10 桔子精油樣品中檸檬烯的含量，分別為 68.5%、71.6%、63.9%、80.2%、72.1%、62.6%、79.8%、71.6%、68.6%、62.1%。

3.2 桔子精油的近紅外光譜的對比

將參與建模的J1～J10 的100 張桔子精油樣品的近紅外光譜圖，置于同一窗口，如圖2 所示。

由圖2 可知，10 種桔子精油的近紅外光譜圖相似程度很高。因受實驗室條件的限制，只有光程差較長的樣品管，所測近紅外光譜圖最大吸收峰的吸光度偏高，建模時所選波段的吸光度值要盡量小于3。

圖2 桔子精油樣品的近紅外光譜圖Fig.2 Near-infrared spectrum of orange essential oil samples

3.3 建立測定桔子精油中檸檬烯含量的定量分析模型

將2.3 選定的訓練集樣品、預測集樣品的近紅外譜圖，導入TQ Analyst 軟件，選偏最小二乘法（PLS）進行建模。在預覽模型中，剔除8 個異常數(shù)據(jù)譜圖，其中包括7 個為訓練集數(shù)據(jù)譜圖，1 個為驗證集數(shù)據(jù)譜圖，最終以93 個訓練集數(shù)據(jù)建立了測定桔子精油中檸檬烯含量的定量分析模型；9 個驗證集數(shù)據(jù)為模型內部驗證集樣品。

經多次篩選得到了建模的最佳光譜范圍，即：同時選擇 6040.58cm-1～6677.65 cm-1、5 857.66 cm-1～5 657.32 cm-1、4 882.88 cm-1～4 801.88 cm-13 段波譜作為建模光譜范圍。在選定的建模光譜范圍的基礎上，對建模的光譜預處理方式的進行篩選，用其校正相關系數(shù)（RC）、校正均方差（RMSEC）、預測相關系數(shù)（RP）、預測均方差（RMSEP）、交互驗證相關系數(shù)（RV）、交互驗證均方差（RMSECV）、模型的性能指數(shù)來評估定量模型的優(yōu)劣。具體指標見表2。

比較表2 中數(shù)據(jù)，某種預處理方式對應的RC、RP、RV3 種相關系數(shù)越接近 1，RMSEC、RMSEP、RMSECV3種均方差越小，且數(shù)據(jù)相近；性能指數(shù)越小，則對應所建模型的預測準確性越好，模型的穩(wěn)定性越好。由表2得出了建模的最佳預處理方式為一階導數(shù)（SG 濾燥）。

表2 不同光譜預處理方式下模型的相關系數(shù)及均方差Table 2 The correlation coefficient and mean square error of models under different spectral pretreatment methods

在上述所選的建模的最佳光譜范圍及最佳預處理方式下建模，得到了模型近紅外光譜（NIR）計算值與標準值之間的相關圖，見圖3，圖4。

圖3 NIR 計算值與標準值之間的相關圖（含內部驗證）Fig.3 Correlation diagram between NIR calculated values and standard values（including internal verification）

圖4 NIR 計算值與標準值之間的交互驗證相關圖Fig.4 Interaction verification correlation diagram between NIR calculated values and standard values

所建模型的 RC為 0.997 7、RMSEC 為 0.412；RP為0.998 2、RMSEP 為 0.396；RV為 0.994 0、RMSECV 為0.662；模型的性能指數(shù)為94.7。所建模型誤差分布圖見圖5。

圖5 NIR 預測值與標準值之間的誤差分布圖Fig.5 Error distribution between NIR predicted values and standard values

從圖5 可知，所建模型NIR 預測值與標準值之間的誤差在-0.8%～1.2%之間。所建模型具有良好的預測能力及穩(wěn)定性。

3.4 定量分析模型的應用

取J1～J10 桔子精油的50 個待測集樣品的近紅外光譜圖，導入所建模型中，用模型預測其檸檬烯的含量。真實值采用GC-MS 測定J1～J10 桔子精油檸檬烯含量的平均值。通過驗證集樣品真實值與預測值的誤差來驗證定量分析模型的準確性。試驗結果見表3。

表3 樣品中檸檬烯的真實值與驗證集樣品的預測值Table 3 The true value of limonene in the sample and the predicted value of the proof set sample

續(xù)表3 樣品中檸檬烯的真實值與驗證集樣品的預測值Continue table 3 The true value of limonene in the sample and the predicted value of the proof set sample

結果顯示，預測J1～J10 桔子精油的檸檬烯含量的平均誤差為0.2%～1.1%，相對誤差為0.3%～1.5%，表明模型具有良好的預測效果。

4 結論

采用近紅外光譜分析技術獲取桔子精油的光譜信息，結合偏最小二乘法（PLS）回歸分析提取光譜信息中的差異，通過化學計量學將光譜信息差異與對應的檸檬烯測定值關聯(lián)，建立桔子精油中檸檬烯含量的近紅外定量分析模型。所建模型的校正相關系數(shù)RC為0.997 7、校正均方差RMSEC 為0.412；預測相關系數(shù)RP為 0.998 2、預測均方差 RMSEP 為 0.396；交互驗證相關系數(shù)RV為0.994 0、交互驗證均方差RMSECV 為0.662；模型的性能指數(shù)為94.7。模型NIR 預測值與標準值之間的誤差在-0.8%～+1.2%之間。所建模型有良好的預測能力及穩(wěn)定性。近紅外光譜技術結合偏最小二乘法（PLS）可以快速檢測桔子精油中檸檬烯的含量，模型準確度高。