四川部分豬場豬3 種呼吸道病原菌分離鑒定及敏感藥物篩選

孫正楠,諸明欣,張煥容

(西南民族大學生命科學與技術學院,四川 成都610041)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)是豬上呼吸道的一種共棲菌,能在特定條件下侵入機體而引起嚴重的全身性疾病,以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征,主要危害2~8 周齡的仔豬,發(fā)病率一般為10%~15%,病死率可達50%以上,部分豬場最高可達80%。豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,A.pleuropneumoniae)是豬傳染性胸膜肺炎的致病菌,疾病以急性出血和慢性纖維素性壞死性胸膜炎病變?yōu)橹饕卣?慢性癥狀表現(xiàn)為可造成豬生長緩慢的肺損傷。而支氣管敗血波氏桿菌(Brodetella bronchiseptica,B.bronchiseptica)可引起豬支氣管肺炎和非進行性萎縮性鼻炎(AR),也是豬呼吸道疾病綜合征(PRDC) 的重要致病因子之一,B.bronchiesptica 的先期感染易于導致其他多種病原的繼發(fā)感染,從而增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴重程度[1-3]。近年來這3 種病原菌的單一分離鑒定及致病性的報道常有,但混合感染情況和綜合分析藥物敏感性的研究匱乏。本研究對四川部分地區(qū)豬場的3 種呼吸道病原菌進行分離鑒定及耐藥情況研究,為四川地區(qū)豬呼吸道病原菌感染及流行情況的相關研究提供科學數(shù)據(jù),并為地區(qū)性豬場合理選用抗菌藥物預防和治療豬呼吸道病原菌感染提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品來源 樣品采自四川地區(qū)邛崍、名山、南充、新津、浦江、大邑等地豬場的病死豬肺部,死亡前出現(xiàn)明顯的呼吸系統(tǒng)癥狀或全身癥狀(如咳嗽、喘氣、極消瘦,拉稀、膿鼻液、關節(jié)腫大,有膿汁等癥狀。)

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、NAD,均購自青島海博生物技術有限公司;阿莫西林、青霉素、紅霉素、羅紅霉素、環(huán)丙沙星、氟哌酸、頭孢拉定、鏈霉素、卡那霉素、氟苯尼考、慶大霉素、氨芐西林、四環(huán)素共14 種藥敏紙片,購自杭州天和微生物試劑有限公司;犢牛血清,購自杭州四季青公司。

2 方法

2.1 3 種病原菌分離鑒定 將樣本以10%犢牛血清和0.01%NAD 的TSA、TSB 培養(yǎng)基進行多次分離培養(yǎng),后挑選單個菌落進行特異性PCR 鑒定,采用表1 中引物。

PCR 反應總體積為25 μL,其中DNA 模板2 μL,上、下游引物各1 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,EX-Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,ddH2O 調(diào)整總體積至25 μL。PCR 反應條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s、Hps 及App 為60 ℃退火30 s;Bb 為56 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s、共35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min,16 ℃反應結束。

表1 本實驗所用PCR 引物

2.2 分離菌株的藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)公布的抑菌環(huán)標準,采用K-B 紙片法藥敏試驗,檢測分離鑒定的挑選的6 株支氣管敗血波氏桿菌、6 株副豬嗜血桿菌及5 株豬胸膜肺炎放線菌對14 種常用抗菌藥物的敏感性。

藥敏試驗中使用的增菌液為10%犢牛血清和0.01% NAD 的TSB 細菌培養(yǎng)液;藥敏平板為含10%犢牛血清及0.01%的TSA 平板。

3 結果

3.1 3 種病原菌的感染率 3 種病原菌感染情況見表2。結果顯示,16 份病死豬肺臟樣本中,感染H.parasuis 的樣本總數(shù)為6,感染率為37.5%;感染B.bronchiseptica 的樣本總數(shù)為6,感染率為37.5%;感染A.pleuropneumoniae 的樣本總數(shù)為5,感染率為31.25%。兩種及兩種以上菌的混合感染情況總數(shù)為4,混合感染率為25%。

3.2 藥敏試驗結果 分離鑒定的B.bronchiseptica、H.parasuis 及A.pleuropneumoniae 都對頭孢噻虧敏感;6 株B.bronchiseptica 對青霉素及氨芐西林完全耐藥;對其他藥物也有一定的耐藥現(xiàn)象;分離的6 株H.parasuis 對羅紅霉素、環(huán)丙沙星完全耐藥;對其他藥物也有一定的耐藥現(xiàn)象;分離的5 株豬A.pleuropneumoniae 對阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素、氟哌酸皆完全耐藥;對其他藥物也有一定的耐藥現(xiàn)象。藥敏試驗結果見表3、4 和表5。

表2 3 種病原菌感染情況

表3 B.bronchiseptica 對14 種藥物的敏感性

表4 H.parasuis 對14 種藥物的敏感性

表5 A.pleuropneumoniae 對14 種藥物的敏感性

4 討論

在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖中,隨著養(yǎng)殖規(guī)模和地域范圍的不斷擴大,疾病的復雜程度也在發(fā)生著變化,混合感染或繼發(fā)感染越來越嚴重。已有報道廣西陸川縣豬群中豬呼吸道疾病綜合征陽性樣本中由包括副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌在內(nèi)的多種病原微生物混合感染的樣本占73.74%[4]。類似的混合感染現(xiàn)象在趙戰(zhàn)勤[5]的研究報道中的來自河北、山東、湖北、河南的樣本中也有記錄。由此可見,混合感染情況在全國范圍已較為常見。在眾多的病原中,病毒性病原與細菌性病原危害最大,特別是細菌性病原作為原發(fā)性與繼發(fā)性感染的主要病原,尤其當發(fā)生混合感染時,防治更為困難。因此,對多病原混合感染與藥物敏感性的研究具有十分重要的研究價值。

本研究對四川地區(qū)6 個豬場的16 頭具有典型呼吸道疾病的綜合征的病死豬肺組織樣本進行了致豬呼吸系統(tǒng)綜合征作用較強的副豬嗜血桿菌、支氣管敗血波氏桿菌和豬胸膜肺炎放線菌3 種細菌的分離鑒定,結果16 份樣本中8 份只被3 種致病菌中的1 種感染,4 份被證明被這3 種致病菌的兩種或兩種以上感染,剩余4 份未查出被這3 種菌的任何一種細菌。16 頭病死豬3 種病原菌混合感染率達到25%,其中,3 種致病菌全部感染的樣本占6.25%,可見3 種致病菌的混合感染應得到重視。

殷松等[6]也曾對四川部分地區(qū)豬呼吸道綜合征細菌性病原做過類似調(diào)查與分析,但并未做出任何的用藥指導和建議,隨著抗菌藥物的廣泛使用和濫用,細菌耐藥性也越來越嚴重,研究致病菌的耐藥情況并提出合理指導對于實際生產(chǎn)是有重要意義的。本研究藥敏試驗結果顯示,分離的6 株支氣管敗血波氏桿菌對阿莫西林、青霉素、紅霉素、羅紅霉素、環(huán)丙沙星、氟哌酸、頭孢拉定、鏈霉素、卡那霉素、氟苯尼考、慶大霉素、氨芐西林、四環(huán)素等抗菌藥物中的卡那霉素及氨芐西林完全耐藥,對其他藥物也有一定的耐藥現(xiàn)象;分離的6 株副豬嗜血桿菌對羅紅霉素、環(huán)丙沙星完全耐藥,對其他藥物也有一定的耐藥現(xiàn)象;分離的5 株豬胸膜肺炎放線菌對阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素、氟哌酸皆耐藥。但所有菌株均對頭孢噻肟較為敏感,提示在這些地區(qū)的豬若出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)急性癥狀但未能確診病因的情況下,可以使用頭孢噻肟進行緊急的嘗試性的治療;而出現(xiàn)可確診的單一感染時可考慮使用相應的敏感藥物治療,使用時應注意用藥量和用藥次數(shù),減緩耐藥性的產(chǎn)生。 另外,胸膜肺炎放線菌的藥敏試驗提示其幾乎對所有革蘭陰性抗菌藥物均產(chǎn)生了耐藥性,這一現(xiàn)象應得到重視。