東方蜜蜂大肚病致病菌的分離鑒定及乳酸菌對(duì)其抑菌效果

汪思凡 曹振輝 潘洪彬

摘要：蜜蜂大肚病會(huì)引起蜂群的大面積死亡，造成巨大損失，通過(guò)無(wú)菌操作采集患大肚病的東方蜜蜂成年工蜂腸道，LB培養(yǎng)基分離培養(yǎng)致病菌，采用形態(tài)分析、生理生化檢測(cè)、16S rDNA基因序列分析和人工攻毒試驗(yàn)對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定;應(yīng)用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)致病菌耐藥性;采用瓊脂孔擴(kuò)散法研究從健康東方蜜蜂成年工蜂腸道中自主分離的瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌對(duì)致病菌的抑制作用。結(jié)果顯示，從患大肚病的東方蜜蜂成年工蜂腸道中共分離得到12株菌株，均為革蘭氏陰性桿菌，根據(jù)形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列分析結(jié)果鑒定12株菌株均為黃桿菌;12株黃桿菌對(duì)氨芐青霉素、鏈霉素、萬(wàn)古霉素、卡那霉素、慶大霉素、新生霉素耐藥，對(duì)阿莫西林敏感;飼喂黃桿菌KMD1和LPD2的東方蜜蜂成年工蜂腹部有明顯膨脹，在飼喂6 d后對(duì)照組蜜蜂死亡率為25%，飼喂黃桿菌KMD1組蜜蜂死亡率為81%，飼喂黃桿菌LPD2組蜜蜂死亡率為73%;瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌均能顯著抑制黃桿菌KMD1和LPD2增殖。鑒定出東方蜜蜂大肚病的致病菌為黃桿菌，東方蜜蜂腸道源乳酸菌對(duì)黃桿菌具有顯著抑菌效果，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)采用微生物制劑防治東方蜜蜂大肚病奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：東方蜜蜂;致病菌;黃桿菌;耐藥性;乳桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)： S895 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0189-04

蜜蜂是一種常見(jiàn)的有益昆蟲(chóng)，屬于膜翅目細(xì)腰亞目針尾部蜜蜂總科蜜蜂科昆蟲(chóng)的統(tǒng)稱(chēng)，作為一種高度社會(huì)性昆蟲(chóng)，其傳染性疾病產(chǎn)生會(huì)呈現(xiàn)爆發(fā)性發(fā)生和混合性發(fā)生的特點(diǎn)，一旦發(fā)病會(huì)表現(xiàn)出流行速度快、發(fā)病區(qū)域廣、致病率高的特點(diǎn)，對(duì)蜂群威脅極大[1]。

蜜蜂大肚子病是一種傳染性極強(qiáng)的蜜蜂疾病，在幾周內(nèi)可蔓延到全群，患病嚴(yán)重的蜂群，死蜂會(huì)堆積滿(mǎn)整個(gè)箱底。該病不分時(shí)節(jié)均可發(fā)生，由于受到外界惡劣環(huán)境的影響，蜜蜂不能出巢，無(wú)法排泄飛翔，導(dǎo)致其后腸積糞膨脹，加上粉蜜源斷絕，僅靠人工飼養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)往往不足，抵抗力減弱，則會(huì)易患此病，患病蜜蜂往往行動(dòng)呆滯，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，較嚴(yán)重者會(huì)完全喪失飛行能力，在麻痹中死亡。該病在蜂群中發(fā)生不僅嚴(yán)重影響了整個(gè)蜂群的健康，還對(duì)蜂群的研究造成了巨大的損失[2]，因此該研究主要針對(duì)引起蜜蜂大肚子病的病原菌進(jìn)行分離鑒定，以期為該病診斷、預(yù)防和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2017年5月分別從云南農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)蜂場(chǎng)（云南昆明）與羅平養(yǎng)蜂場(chǎng)（云南羅平）隨機(jī)各取12只東方蜜蜂成年工蜂，通過(guò)無(wú)菌操作分別取出其腸道。

1.1.2 乳酸菌菌株 瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和羅伊氏乳桿菌（L. reuteri），由筆者所在課題組從健康東方蜜蜂腸道內(nèi)自主分離，GenBank登錄號(hào)為MG574870和MG574871。

1.1.3 主要試劑 LB培養(yǎng)基，革蘭氏染色劑，葡萄糖、鼠李糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、甘露醇、甘露糖，藥敏試紙，購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司;DNA快速抽提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;Taq DNA聚合酶，購(gòu)自上海Promega生物產(chǎn)品有限公司;DL2000 DNA marker，購(gòu)自TaKaRa公司;溶菌酶，購(gòu)自Sigama公司;16S rDNA引物，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 東方蜜蜂大肚病致病菌的分離 在無(wú)菌條件下取出蜜蜂腸道，轉(zhuǎn)移入1.5 mL離心管中，勻漿后接入LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，富集后將培養(yǎng)液梯度稀釋接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)后從平板中挑取每個(gè)樣品中菌落形態(tài)不同的單菌落，純化3次后于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆肹3]。

1.2.2 東方蜜蜂大肚病致病菌的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定 將分離所得菌株分別通過(guò)革蘭氏染色試驗(yàn)、接觸酶測(cè)定試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、硝酸銀試驗(yàn)[4]對(duì)分離所得菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 按照生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速抽提試劑盒（SK8225）說(shuō)明書(shū)對(duì)菌株進(jìn)行基因DNA的提取，以提取DNA為模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：2×Ex Taq buffer 25 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O2 1 μL，共50 μL體系;PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸 10 min，4 ℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，檢驗(yàn)擴(kuò)增成功的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定序列后分析比對(duì)并通過(guò)ClustalX 2.0和Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)分離所得菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 抗生素敏感性試驗(yàn) 采用濾紙片擴(kuò)散法，取分離株菌懸液0.5 mL加入10 mL溫度約50 ℃的LB固體培養(yǎng)基中迅速混勻，倒入已鋪底的平皿中，待培養(yǎng)基凝固后，貼放標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，測(cè)量抑菌圈直徑[5]。試驗(yàn)用抗生素的種類(lèi)、藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.2.4 人工感染試驗(yàn)

1.2.4.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的建立 將黃桿菌接種至LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，活化3次，用肉湯培養(yǎng)基稀釋菌液至D600 nm值在0.2～0.8之間，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)量D600 nm，以稀釋后D600 nm值在0.2～0.8之間的菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂尯蟮木壕鶆虻丶拥江傊桨迳希?7 ℃培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。

1.2.4.2 攻毒 從云南農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)蜂場(chǎng)捉取300只東方蜜蜂成年工蜂，平均分為3組，分別飼養(yǎng)在3個(gè)自制培養(yǎng)箱中，試驗(yàn)Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂普通無(wú)菌糖水，試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組分別飼喂添加有108 CFU/mL黃桿菌的糖水，試驗(yàn)過(guò)程均保證充足糖、水的供應(yīng)[6]。

1.2.5 乳酸菌對(duì)黃桿菌的體外抑制作用 瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌37 ℃厭氧過(guò)夜培養(yǎng)，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min）收集上清液，調(diào)節(jié)pH值至6.2備用。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法，將黃桿菌37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，吸取0.02 mL菌液于 20 mL 溫度50 ℃的TSA中劇烈混合后傾注平板，將中和的乳酸菌培養(yǎng)上清液加入80 mm瓊脂孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑（mm），并與參考菌株鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）GG比較[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 東方蜜蜂大肚病致病菌的分離

在無(wú)菌條件下取出蜜蜂腸道，轉(zhuǎn)移入1.5 mL離心管中，勻漿后接入LB培養(yǎng)基中，通過(guò)純化培養(yǎng)共分離得到12株分離菌，（編號(hào)為KMD1、KMD2、KMD3、KMD4、KMD5、KMD6、KMD7、KMD8、KMD9、LPD1、LPD2、LPD3），分離純化后的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)的觀察情況見(jiàn)表2。

2.2 東方蜜蜂大肚病致病菌的分離

2.2.1 生理生化鑒定 將分離得到的12株分離菌進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、糖類(lèi)發(fā)酵、硫化氫、硝酸銀的生理生化試驗(yàn)，由表3、表4可知，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》，篩選分離出的12株菌生理生化特性符合黃桿菌的特征。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

2.2.2.1 16S rDNA序列的同源性分析 將測(cè)序得到12株分離菌的16S rDNA序列利用NCBI的BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，12株分離菌株的比對(duì)結(jié)果顯示為黃桿菌（表5）。

2.2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI的Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)取已收錄的黃桿菌16S rDNA序列，運(yùn)用Mage 5.0和ClustalX 1.83構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，由圖1可知，所有分離菌與黃桿菌屬中的F. frigidimaris親緣性最近，結(jié)合 16S rDNA 序列同源性分析結(jié)果，表明從患大肚病的東方蜜蜂的腸道中分離得到的12株分離菌均為黃桿菌。

2.2.3 人工攻毒試驗(yàn)

2.2.3.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的建立 選擇KMD1、LPD2 2株黃桿菌對(duì)成年?yáng)|方工蜂進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，分別建立KMD1、LPD2 2株黃桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，由圖2、圖3可知，黃桿菌KMD1的D值（y）與菌落數(shù)（x）的線(xiàn)性關(guān)系為y=（21.969x+1.015 1）×108，r2為 0.990 1;黃桿菌LPD2的D值（y）與菌落數(shù)（x）的線(xiàn)性關(guān)系為y=（13.092x+1.755 7）×108，r2為0.991 8。

2.2.3.2 蜜蜂死亡率 飼喂KMD1組為試驗(yàn)Ⅱ組，飼喂LPD2組為試驗(yàn)Ⅲ組，由圖4可知，飼喂6 d后試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅲ組相較對(duì)照組死亡率均顯著上升（P<0.05），對(duì)照組蜜蜂死亡率為25%，試驗(yàn)Ⅱ組蜜蜂死亡率為81%，試驗(yàn)Ⅲ組蜜蜂死亡率為73%。與對(duì)照組比較，黃桿菌攻毒組蜜蜂腹部有明顯膨脹、行動(dòng)遲緩，多在箱底爬行，使用小鑷子擠壓蜜蜂尾部，會(huì)排出糞便，嗅其味臭。

2.3 抗生素敏感性試驗(yàn)

對(duì)12株黃桿菌采用濾紙片擴(kuò)散法[5]進(jìn)行抗生素敏感試驗(yàn)，抗生素敏感性的判定參照WHO提供的CLSI最新版的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。由表6可知，12株黃桿菌對(duì)氨芐青霉素、鏈霉素、萬(wàn)古霉素、卡那霉素、慶大霉素、新生霉素基本耐藥，對(duì)阿莫西林敏感。

2.4 乳酸菌對(duì)黃桿菌的體外抑制作用

由表7可知，東方蜜蜂腸道源乳酸菌瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的培養(yǎng)上清液對(duì)12株黃桿菌具有顯著抑制作用，抑菌活性?xún)?yōu)于或與參考菌株LGG相當(dāng)。

3 討論與結(jié)論

本研究從東方蜜蜂成年工蜂腸道中分離出了蜜蜂大肚病的致病菌，通過(guò)生理生化分析、分子生物學(xué)鑒定和攻毒試驗(yàn)，鑒定其為黃桿菌科黃桿菌屬菌株。抗生素敏感性試驗(yàn)測(cè)定了致病菌對(duì)各種抗生素的敏感程度，確定了12株黃桿菌對(duì)氨芐青霉素、鏈霉素、萬(wàn)古霉素、卡那霉素、慶大霉素、新生霉素基本耐藥，對(duì)阿莫西林敏感。因此，在治療蜜蜂大肚病的過(guò)程中，可以適量使用阿莫西林。Decostere等報(bào)道，從熱帶魚(yú)中分離出的柱狀黃桿菌對(duì)新生霉素耐藥[8]，與本試驗(yàn)結(jié)果較一致。但陳昌福等報(bào)道，從湖北各地分離的柱狀黃桿菌對(duì)大多數(shù)供試抗生素均高度敏感[9];黃文芳等亦報(bào)道其分離的柱狀黃桿對(duì)多種抗生素、呋喃類(lèi)敏感，共27種藥物僅對(duì)磺胺噻唑不敏感，皆與本研究結(jié)果差異較大[10]。分析結(jié)果可能由于不同宿主、不同地域、不同分離菌株間的藥物耐藥性具有一定的差異，亦可能是由于抗生素濫用致使細(xì)菌具有了耐藥機(jī)制，亦或是長(zhǎng)期使用小劑量抗生素，不僅未達(dá)到殺菌目的，反而逐步誘發(fā)了細(xì)菌的耐藥性。因此，在規(guī)模化蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中，對(duì)于治療蜜蜂疾病，一定要做到查明病因，科學(xué)化、合理化地使用抗生素，同時(shí)在藥物的使用上也須做到聯(lián)合使用、交叉使用的方法，不僅可以充分發(fā)揮藥物的療效，也可以避免細(xì)菌長(zhǎng)期與一種藥物接觸，產(chǎn)生耐藥機(jī)制[11]。

乳酸菌作為一種益生菌其在抑制腸道致病菌的方面已有了廣泛研究，乳酸菌能產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素，具有抑菌作用，且其還可以通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)腸上皮細(xì)胞黏附位點(diǎn)，達(dá)到抑制致病菌的作用[12]。本研究采用從健康東方蜜蜂腸道內(nèi)分離出的2株乳酸菌（瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌），首次研究了其對(duì)蜜蜂大肚病致病菌黃桿菌的抑制作用，結(jié)果顯示這2株乳酸菌均具有顯著抗菌活性，為采用微生物制劑防治蜜蜂疾病、降低抗生素依賴(lài)性提供了理論依據(jù)。

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