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    生防芽孢桿菌對(duì)黃瓜根際土壤酶活性的影響

    2019-09-17 07:32:25閆楊劉月靜王帥珂
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年7期
    關(guān)鍵詞:土壤酶活性土壤肥力

    閆楊 劉月靜 王帥珂

    摘要:采用溫室盆栽試驗(yàn)的方法,研究3株對(duì)黃瓜枯萎病具有較強(qiáng)抑制作用的芽孢桿菌(Bacillus subtilis) B579、Bacillus subtilis 2-1、Bacillus amyloliquefaciens 9-2對(duì)黃瓜根際土壤關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果表明,生防菌的施入能明顯提高黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶、過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶和脲酶等4種與土壤肥力相關(guān)酶的活性。其中,生防菌處理的酶活性最高,其次為拮抗處理和空白對(duì)照處理,病原菌處理的酶活性最低。因此,生防菌處理不僅對(duì)黃瓜具有防病促生長(zhǎng)的作用,同時(shí)還能提高土壤關(guān)鍵酶活性,增加土壤肥力,為今后生態(tài)環(huán)保型生防菌劑的開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:生防芽孢桿菌;土壤酶活性;黃瓜枯萎病;土壤肥力

    中圖分類號(hào): S476+.9 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號(hào):1002-1302(2019)07-0108-03

    黃瓜枯萎病是一種嚴(yán)重危害黃瓜的土傳性真菌病害[1],其病原為鐮孢菌屬的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),病菌主要侵入幼根或傷口,使瓜葉迅速萎蔫。一般苗圃黃瓜的枯萎病發(fā)病率為20%~50%,嚴(yán)重的可達(dá)80%以上。土壤是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的樞紐[2],負(fù)責(zé)物質(zhì)與能量交換,而土壤酶作為土壤中具有高度催化作用的蛋白質(zhì),主導(dǎo)著土壤中與物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化有關(guān)的生物化學(xué)過程[3]。土壤酶的生物活性指標(biāo)一直是土壤酶學(xué)研究的重點(diǎn),并逐漸成為土壤微生物生態(tài)效應(yīng)研究的重要方向和領(lǐng)域[4-7]。土壤酶活性的高低可較有效地反映土壤中各種生化反應(yīng)的強(qiáng)度和方向,代表著土壤中物質(zhì)代謝的旺盛程度,是土壤肥力的重要指標(biāo)[8]。脲酶是土壤中最活躍的水解酶類,是廣泛存在于細(xì)菌、真菌和高等植物中的酰胺酶,與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量等密切相關(guān),能水解土壤中的尿素,釋放出供作物利用的銨,其活性與土壤肥力水平顯著相關(guān)[9]。土壤過氧化氫酶活性與土壤的呼吸強(qiáng)度及土壤微生物活動(dòng)相關(guān),是重要的土壤微生態(tài)環(huán)境指示因子,可以表現(xiàn)出土壤氧化還原的能力[10],能有效防止過氧化氫的毒害[11]。堿性磷酸酶屬于水解酶類,土壤中的有機(jī)磷在土壤磷酸酶的酶促作用下才能轉(zhuǎn)化為可利用的形態(tài)[12]。幾丁質(zhì)酶參與土壤有機(jī)碳和氮的轉(zhuǎn)化,可以將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基糖,是土壤中礦質(zhì)氮的主要來源[13-14]。

    芽孢桿菌是一類好氧和兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[15],對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,可以將物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)成分供給植物或者刺激土壤中微生物的繁殖以增強(qiáng)土壤肥力,使植物處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)[16]。目前已有的研究大多是僅針對(duì)生防菌提高根際土壤中關(guān)鍵酶活性來進(jìn)行的,本研究中引入枯萎病病菌進(jìn)行生防菌的拮抗性試驗(yàn)。前期研究表明[17-19],3株生防菌的施入不僅具有防病促生長(zhǎng)的作用,同時(shí)還能提高根際土壤中微生物類群的多樣性。因此,本研究將進(jìn)一步揭示3株生防芽孢桿菌對(duì)黃瓜根際土壤中4種關(guān)鍵酶活性的影響,為今后生防芽孢桿菌菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)于聊城大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行,供試黃瓜品種為津優(yōu)1號(hào)。供試菌株為枯萎病病菌(Fusarium oxysporum),由天津科潤(rùn)黃瓜研究所分離保存;芽孢桿菌B579、2-1、9-2等3株生防菌株均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離并保存??莶菅挎邨U菌B579從天津近郊蔬菜種植區(qū)根圍土分離所得,溫室盆栽試驗(yàn)表明,它對(duì)黃瓜枯萎病有顯著的抑制作用,并能促進(jìn)植物生長(zhǎng);枯草芽孢桿菌2-1從聊城市茌平縣杜郎口鎮(zhèn)中藥材種植基地感染根腐病的丹參根際土壤篩選分離得到,對(duì)丹參根腐病具有生物防治作用;解淀粉芽孢桿菌9-2從聊城本地感染根腐病的中藥材天南星的根際土壤中篩選分離得到,對(duì)天南星根腐病具有較好的生物防治作用??菸〔【捎肞DA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);芽孢桿菌的培養(yǎng)采用LB液體和固體培養(yǎng)基。 酶活性測(cè)定選用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的土壤酶活性測(cè)定試劑盒。

    1.2 方法

    1.2.1 菌液培養(yǎng) (1)芽孢桿菌菌液培養(yǎng):將斜面保藏的生防芽孢桿菌B579、2-1、9-2菌種分別轉(zhuǎn)入內(nèi)裝30 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)15~16 h,獲得種子液。將1%種子液接種于內(nèi)裝100 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,37 ℃條件下180 r/min恒溫振蕩15~16 h,培養(yǎng)結(jié)束后將菌液制備成 1×106 CFU/mL的發(fā)酵液[18]。(2)枯萎病病菌菌液培養(yǎng):將枯萎病病菌FO在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)生明顯孢子,用無菌水制備成濃度為1×106 個(gè)/mL的孢子懸液。

    1.2.2 試驗(yàn)處理 春季培養(yǎng)黃瓜幼苗至2~3張真葉,將幼苗移栽至直徑為30 cm、高為30 cm的花盆中,每盆2~3株幼苗,共計(jì)48盆。共設(shè)置8組處理,每組6個(gè)平行,分別為:① 空白處理(CK),清水澆灌;② 枯萎病病菌處理,枯萎病病菌FO菌液澆灌;③ B579處理,B579菌液澆灌;④ B579+FO拮抗處理,B579菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌;⑤ 2-1處理,2-1 菌液澆灌;⑥2-1+FO拮抗處理,2-1菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌;⑦ 9-2處理,9-2菌液澆灌;⑧ 9-2+FO拮抗處理,9-2菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌。①組澆灌清水50 mL,②③⑤⑦組接種量50 mL,④⑥⑧組接種量為生防菌液與枯萎病病菌菌液各50 mL。

    1.2.3 菌液灌根處理 在黃瓜根部進(jìn)行菌液灌根處理。黃瓜在自然條件下,生長(zhǎng)周期為90~120 d,其生長(zhǎng)發(fā)育一般經(jīng)歷發(fā)芽期、幼苗期、初花期和結(jié)果期4個(gè)階段。因此每盆黃瓜從進(jìn)行菌液澆灌之日算起,分別在4、8、12和16周在各株黃瓜根際土壤約5~15 cm深處取樣,測(cè)定土壤堿性磷酸酶(ALP)、過氧化氫酶(AT)、幾丁質(zhì)酶、脲酶(UE)4種不同酶活性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶活性的影響

    由圖1可知,生防菌處理(B579、2-1、9-2)酶活性變化趨勢(shì)與空白處理相似,均為在處理后4周和8周升高,在12周和16周降低,即變化趨勢(shì)為先升高后降低,且生防菌處理在16周時(shí)堿性磷酸酶活性均明顯高于空白處理組,其次為3組拮抗處理,枯萎病病菌FO處理酶活性最低,并且生防菌處理8周后酶活性逐漸降低,因此生防菌在堿性磷酸酶的酶活性中體現(xiàn)出其最佳使用周期為8周。

    2.2 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中過氧化氫酶活性的影響

    由圖2可知,空白處理組與生防菌B579、2-1和9-2處理基本都為先升高再降低的趨勢(shì),這4種處理酶活性在整個(gè)生長(zhǎng)期都處于較高狀態(tài),且在處理12周時(shí)均為最高酶活性,而后3種處理在整個(gè)生長(zhǎng)周期的酶活性均略高于對(duì)照,考慮為生防菌益生作用的結(jié)果。在8組處理的不同時(shí)期,F(xiàn)O處理組過氧化氫酶活性均處于最低狀態(tài)。FO處理與B579+FO,2-1+FO拮抗處理酶活性均處于先降低再升高再降低的趨勢(shì),而9-2+FO拮抗處理則與生防菌處理組變化趨勢(shì)相同,含F(xiàn)O的4種處理最后的過氧化氫酶活性基本相同。此結(jié)果的原因考慮為在黃瓜的生長(zhǎng)過程中生防菌對(duì)FO病菌的拮抗作用由強(qiáng)變?nèi)踔敝料В瑢?duì)產(chǎn)生過氧化氫酶的微生物影響力逐漸減小,故4種處理過氧化氫酶活性在16周時(shí)基本相同。由此可見,由生防菌處理的黃瓜植株根際土壤過氧化氫酶活性在整個(gè)處理期均處于較高狀態(tài),且其最佳使用周期為12周。拮抗處理組酶活性相對(duì)較低,但介于生防菌處理組與對(duì)照處理組之間,表明生防菌對(duì)土壤根際的過氧化氫酶活性能產(chǎn)生積極影響。

    2.3 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中幾丁質(zhì)酶活性的影響

    由圖3可知,空白處理組的幾丁質(zhì)酶活性變化趨勢(shì)為先升高再降低,而其他7組處理的酶活性變化趨勢(shì)為先升高再降低再升高。FO處理組在16周的酶活性仍低于同時(shí)期對(duì)照的酶活性。在生防菌(B579、2-1、9-2)處理和生防菌+FO(B579+FO、2-1+FO、9-2+FO)拮抗處理的比較中可以明顯看出,生防菌處理各時(shí)期幾丁質(zhì)的酶活性均高于相應(yīng)拮抗處理同時(shí)期的酶活性(除8周時(shí)的9-2)。由此可見,各處理與空白處理對(duì)于黃瓜根際土壤中的幾丁質(zhì)酶活性變化趨勢(shì)無太大相似性,而FO處理與各生防菌處理、拮抗處理組具有相同趨勢(shì),且FO處理組的酶活性在各個(gè)時(shí)期仍為最低,并且生防菌處理8周后酶活性均明顯降低。

    2.4 不同時(shí)期不同處理對(duì)黃瓜根際土壤中脲酶活性的影響

    由圖4可知,在處理4周時(shí)空白處理組和生防菌處理土壤脲酶活性均較高,且在4個(gè)處理中的變化趨勢(shì)為先升高再降低再升高。而FO處理與各拮抗處理在4周時(shí)土壤脲酶活性均較低,且在4個(gè)處理中的變化趨勢(shì)基本與前面4組相似,即同為先升高再降低再升高,且8組處理在16周時(shí)根際土壤中脲酶活性均處于較高狀態(tài)。

    3 討論

    研究表明,3種生防芽孢桿菌B579、2-1、9-2均能提高黃瓜根際土壤的酶活性。在黃瓜根際施加生防芽孢桿菌菌液后,僅施加生防菌的3組處理的4種酶活性與空白處理的酶活性相比結(jié)果如下:僅施加生防菌的3個(gè)不同處理組各個(gè)取樣時(shí)期的堿性磷酸酶活性明顯高于對(duì)照;不同取樣時(shí)期過氧化氫酶活性均略高于空白處理,這一結(jié)果與曾慶賓等對(duì)微生物菌劑對(duì)烤煙根際土壤過氧化氫酶活性的研究結(jié)果[20]一致,而劉素慧等在EM(有效微生物)對(duì)連作大蒜根際土壤酶活性的影響中也得出了相似結(jié)論[21];各生防菌處理不同時(shí)期的幾丁質(zhì)酶活性相較于空白處理組在總體上同樣偏高;各生防菌處理組不同時(shí)期的脲酶活性與空白處理組相比均有提高,且其變化趨勢(shì)與尹淑麗等不同生防菌對(duì)黃瓜根際土壤酶活性的研究結(jié)果[1]一致。因此,總體上來說,生防芽孢桿菌可提高黃瓜土壤根際的4種不同土壤酶的活性,同時(shí)可說明生防菌對(duì)于植株的生長(zhǎng)具有促生作用。

    在用枯萎病病菌FO處理后,可明顯發(fā)現(xiàn)FO處理組不同時(shí)期的4種酶活性相較于空白處理組均明顯降低。而各拮抗處理組的酶活性與FO處理組相比較的情況如下:不同時(shí)期的B579+FO、2-1+FO與9-2+FO 3組拮抗處理的堿性磷酸酶活性均明顯高于FO處理,且這3組處理的堿性磷酸酶活性高于空白處理組,低于對(duì)應(yīng)的僅加入生防菌的處理組,表明生防菌對(duì)于施加了枯萎病病菌的黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶活性有較大影響;這3組處理不同時(shí)期的過氧化氫酶活性明顯高于FO處理組但低于空白處理組;拮抗處理組不同時(shí)期的幾丁質(zhì)酶活性相較于FO處理組的變化與堿性磷酸酶活性相似,這與王倡憲等對(duì)黃瓜苗期根系抗病相關(guān)酶活性的研究結(jié)果[22]相似;拮抗處理組不同時(shí)期的脲酶活性無明顯規(guī)律性,但總體能看出施加生防菌的FO的處理組脲酶活性較僅施加FO處理組高。根據(jù)4種不同酶活性的變化,在FO病菌存在的前提下,施加生防菌可提高黃瓜根際土壤的酶活性,聯(lián)系筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究[17,23],說明生防菌對(duì)于枯萎病病菌存在較明顯的拮抗作用。但對(duì)于生防菌防病促生長(zhǎng)作用的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

    4 結(jié)論

    在植株根際土壤中施入生防芽孢桿菌菌株可以提高土壤中的酶活性,從而可改善土壤結(jié)構(gòu),增強(qiáng)土壤肥力,有利于土壤的健康發(fā)展。本研究通過設(shè)置多種對(duì)照處理研究不同生防菌對(duì)不同土壤酶活性的影響程度,表明生防菌不僅在植株生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到促生作用,而且對(duì)可能存在的致病菌起到拮抗作用,能有效防止枯萎病的發(fā)生,為今后生態(tài)環(huán)保型生防菌劑的開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)。

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