鏈霉菌JD211所產(chǎn)活性物質(zhì)對水稻種子萌發(fā)及葉片防御反應的影響

李張 徐志榮 汪青松

摘要：為了研究鏈霉菌JD211所產(chǎn)活性物質(zhì)對水稻種子萌發(fā)及葉片抗性酶活性的影響，用不同比例的JD211固體發(fā)酵物浸提液處理水稻種子和根系，測定種子發(fā)芽率、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量、根系活力以及葉片抗性酶活性的變化。結果表明，用適宜比例的JD211浸提液處理種子，種子發(fā)芽率、蛋白質(zhì)含量及根系活力高于對照，用稀釋比例為 1 ∶ 2 500 JD211浸提液處理的根系活力比對照高41.5%，可溶性糖含量略低于對照;用稀釋比例為1 ∶ 320的浸提液處理根系60 h后，水稻葉片中的5種抗性酶活性明顯優(yōu)于對照。

關鍵詞：鏈霉菌JD211;活性物質(zhì);防御酶;可溶性糖;根系活力;水稻

中圖分類號： S351.1;S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0095-04

鏈霉菌是高等放線菌，可產(chǎn)生多種抗生素、植物激素等活性物質(zhì)，對于提高植物的抗病、抗逆性能具有重要的作用，具有用于開發(fā)生物農(nóng)藥的潛力[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌可以作為根際促生菌[2]，其代謝產(chǎn)物可以促進種子的萌發(fā)[3]。趙娟等研究發(fā)現(xiàn)，生防菌能夠提高根系質(zhì)量和根系活力[4]。

植物的抗病性表現(xiàn)為一系列復雜的生理生化變化，包括植物細胞內(nèi)活性氧的積累與清除、抗病信號的產(chǎn)生與轉導、防衛(wèi)反應的表達與調(diào)控等。在這一系列復雜的過程中，一些相關酶類起著很重要的調(diào)控作用，如過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等[5]。梁軍鋒等發(fā)現(xiàn)，用47W08、47W10、48G10、48G15、512G04、51W06、82W09等7株放線菌大都能誘導多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性增加[6]。杜亞楠等發(fā)現(xiàn)，用農(nóng)抗702浸泡水稻葉片可以提高水稻葉片的抗性酶活性[7]。

鏈霉菌JD211是從江西廬山珙桐植株體內(nèi)分離篩選得到的，其產(chǎn)生的活性組分對多種植物病原真菌有較強的抑菌作用[8]。邵正英等研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌JD211能夠提高水稻根系超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗性酶活性[9]。徐志榮等用鏈霉菌JD211發(fā)酵液處理水稻葉片，發(fā)現(xiàn)能夠誘導葉片過氧化氫酶活性[10]。但是鏈霉菌JD211所產(chǎn)活性物質(zhì)對水稻種子萌發(fā)的影響以及用其處理根系對水稻葉片抗性酶活性影響的研究目前尚未開展。本研究采用JD211固體發(fā)酵物浸提液處理水稻種子和根系，探討JD211所產(chǎn)活性物質(zhì)對水稻種子萌發(fā)及葉片防御反應的影響，旨在為該生防菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的促生防病作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為鏈霉菌JD211，由江西農(nóng)業(yè)大學應用微生物研究所提供。供試水稻品種為陸兩優(yōu)996，購自北京金色農(nóng)華種業(yè)股份有限公司。供試土壤為江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院實訓基地的菜園土。試驗于2017年6—9月在江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院實訓基地進行。土壤基本理化性質(zhì)如下：有機質(zhì)含量為32.58 g/kg，全氮含量為 1.756 g/kg，堿解氮含量為109.9 mg/kg，速效磷含量為 21.6 mg/kg，速效鉀含量為88.5 mg/kg，pH值為6.4。

1.2 試驗方法

1.2.1 固體發(fā)酵物浸提液的制備 將鏈霉菌JD211固體發(fā)酵物[8]、蒸餾水的體積比設為1 ∶ 1，浸提24 h，用0.22 μm濾膜過濾除菌，得到的浸提液即為JD211原液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鏈霉菌JD211對水稻種子萌發(fā)的影響 用稀釋300倍的“84”消毒液對水稻種子表面消毒10～15 min，然后用無菌水沖洗3～5次，于30 ℃浸種12 h，再將種子置于鋪有2層濾紙、含有10 mL不同濃度JD211的平皿中。將JD211分別稀釋成原液濃度的1/2 500、1/1 250、1/1 000、1/250、1/125、1/50，以無菌水作為空白對照，另以10 μg/mL赤霉素作為陽性對照。每皿設30粒種子，3個重復。于30 ℃黑暗培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72 h記錄各組的發(fā)芽情況（以幼芽長度達到種子長度的1/2，且幼根與種子等長為發(fā)芽標準，兩者需要同時滿足）。

1.2.3 鏈霉菌JD211對水稻種子蛋白質(zhì)、可溶性糖含量及根系活力的影響 稱取1 g萌發(fā)72 h的水稻種子，去根、芽、谷皮后，置于研缽中，加入pH值為5.6的檸檬酸緩沖液和石英砂，研磨成勻漿后倒入20 mL刻度管中，定容至10 mL，振蕩混勻，于20 ℃放置15 min（4 min振蕩1次），于3 ℃、6 000 r/min 離心10 min，取上清液備用。用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量（鮮質(zhì)量含量）[11]，用蒽酮法測定可溶性糖含量[12]，用氯化三苯基四氮唑法（TTC）測定根系活力[13]。

1.2.4 播種與水稻培育 種子消毒后，用蒸餾水沖洗3～4次，催芽24 h，播種于裝有2 kg菜園土的塑料桶中，菜園土為過20目的細土，桶內(nèi)直徑為23 cm，高為17 cm，每桶澆水且無明水，播種100粒，再在表面撒1層過100目的細土，灑水，將細土浸濕，微露種子。每天定時定量澆水。

1.2.5 鏈霉菌JD211浸泡根系對水稻抗性相關酶活性的影響 將生長至3葉1心期的水稻苗從桶中連泥一起挖出，用流水將其根系沖洗干凈，然后放入含有不同濃度JD211浸提液的組培瓶中，將根全部浸沒，在每個組培瓶中放入30株水稻苗，分別將JD211稀釋為原液濃度的1/320、1/640、1/1 280、1/2 560，以蒸餾水作空白對照，10 μg/mL赤霉素作陽性對照，每個濃度設5個重復，每天定時定量補充溶液，于30 ℃空調(diào)房內(nèi)培養(yǎng)，處理12、24、36、48、60 h后取樣測定相關酶活性。過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶活性的測定參照文獻[14];過氧化物酶活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[15]，以470 nm處的吸光度在1 min內(nèi)變化0.01為1個酶活性單位U，單位質(zhì)量葉片中的酶活性單位即為U/g;多酚氧化酶活性在 398 nm 處測定[16];超氧化物歧化酶活性的測定采用氮藍四唑法[17]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析方法 采用WPS 2017進行數(shù)據(jù)處理，用DPS 8.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 鏈霉菌JD211浸提液對水稻種子萌發(fā)的影響

由表1可見，催芽24 h后，原液濃度1/1 250處理組水稻種子的發(fā)芽率明顯高于其他組。在培養(yǎng)24～48 h，原液濃度 1/1 000 的處理組的發(fā)芽率提高了57.77百分點，培養(yǎng)72 h后比空白對照組提高了11.11百分點。培養(yǎng)72 h時，原液濃度1/1 250、1/1 000、1/250處理組的發(fā)芽率分別比空白對照組提高了1.11、11.11、2.22百分點;低濃度（原液濃度的 1/2 500、1/1 250）JD211處理組的發(fā)芽率與空白對照組差異不明顯，中等濃度（原液濃度的1/1 000、1/250）JD211處理組的發(fā)芽率明顯高于空白對照組，甚至超過赤霉素處理組;高濃度（原液濃度的1/125、1/50）JD211處理組的發(fā)芽率明顯低于空白對照組。

2.2 鏈霉菌JD211浸提液對種子可溶性糖、蛋白質(zhì)含量及根系活力的影響

由圖1可知， 經(jīng)過各個稀釋比例浸提液處理的種子可溶性糖含量無明顯差異，且比空白對照略低。赤霉素處理組的可溶性糖含量高于其他處理組。處理組的蛋白質(zhì)含量有了顯著的提高，都高于空白對照組，高出幅度為15.7%～37.1%，其中浸提液濃度的1/1 250、1/250這2個處理的蛋白質(zhì)含量分別為3.99、4.03 mg/g，分別比赤霉素處理的高4.4%、5.1%。

由圖2可知，鏈霉菌JD211浸提液濃度1/2 500、1/1 250、1/1 000、1/250、1/50處理組的根系活力分別為447、363、383、331、412 mg/（g·h），分別比空白對照組的根系活力[316 mg/（g·h）]高41.5%、14.9%、21.2%、4.7%、30.4%。浸提液濃度1/2 500處理組的根系活力比赤霉素處理組高 6.68%。結果說明，JD211浸提液對根系活力有明顯的促進作用。

2.3 鏈霉菌JD211浸提液處理根系對水稻葉片抗性酶活性的影響

以不同稀釋比例的鏈霉菌JD211浸提液浸泡根系60 h，由表2可以看出，浸提液濃度 1/320 處理的5種防御酶活性都高于對照組，且過氧化氫酶、過氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶活性都是各個處理組中最高的。因此，用1/320 JD211浸提液處理水稻根系，進一步研究不同處理時間對防御酶活性的影響。

2.3.1 不同JD211浸提液處理濃度對水稻葉片防御酶活性的影響 由表2可知，JD211浸提液濃度1/1 280處理的葉片超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組，JD211浸提液濃度 1/1 280、1/640、1/320處理的超氧化物歧化酶活性分別比對照組高28.9%、22.8%、25.4%;過氧化氫酶活性以JD211浸提液濃度1/320處理最佳，為 1 056.67 U/g，比對照高26.3%;試驗組過氧化物酶活性均高于對照組，JD211浸提液濃度為1/2 560、1/1 280、1/320處理的過氧化物酶活性分別比對照組高78.5%、73.9%、221.5%;JD211浸提液濃度 1/2 560、1/1 280處理的多酚氧化酶活性優(yōu)于低稀釋比例處理及對照，且各個稀釋比例處理與對照組間有顯著差異;苯丙氨酸解氨酶活性最佳的處理為JD211浸提液濃度的1/320處理，比CK高48.9%。

2.3.2 不同JD211浸提液處理時間對水稻葉片防御酶活性的影響 由表3可以看出，超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性都隨時間的增加出現(xiàn)先降后升的趨勢，在處理60 h時酶活性最高，分別為586.36、464.44 U/g，在48～60 h超氧化物歧化酶活性相比其他時間段上升幅度更大。從整體上看，過氧化物酶活性主要在處理的后期發(fā)揮作用;過氧化氫酶活性在處理12 h時最大，為1 573.33 U/g，在12～24 h CAT活性快速下降，在其他時間段的活性變化較小;多酚氧化酶活性的變化趨勢為先升后降再升，在12～24 h PPO活性大幅度上升，在36 h時達到峰值，且各時間段間的多酚氧化酶活性差異顯著（P<0.05）;苯丙氨酸解氨酶活性在60 h達到最大值，在 48～60 h期間，PAL活性出現(xiàn)大幅度的增加，趨勢遠大于其他時間段。

3 結論與討論

本研究結果表明，適宜濃度的鏈霉菌JD211浸提液能夠提高水稻種子的發(fā)芽率，效果甚至比赤霉素處理的更佳。在適宜濃度的鏈霉菌JD211浸提液處理下，種子中的蛋白質(zhì)含量、根系活力都有所提高，而可溶性糖含量略有下降;用適宜濃度的鏈霉菌JD211浸提液處理水稻根系，葉片過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性有明顯提高。由此可見，鏈霉菌JD211的分泌代謝產(chǎn)物可以促進種子萌發(fā)，這與靳振江等的研究結果[3]一致，而發(fā)芽率對不同濃度的JD211浸提液處理表現(xiàn)出“低促高抑”，可能是由于高濃度的浸提液破壞了其中的抗氧化機制[18]。白永富等發(fā)現(xiàn)，在種子萌發(fā)過程中，酶將貯藏在種子內(nèi)的物質(zhì)分解成游離的氨基酸，再合成新的蛋白質(zhì)用于新細胞建成，在這個過程中，隨著儲藏蛋白質(zhì)的降解，可溶性蛋白含量也隨之增加[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，根系活力與植物抗病性呈正相關。

植物的誘導抗病性是遇到外界環(huán)境脅迫或者病原菌的傷害時所產(chǎn)生的一種獲得性抗性[20]。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸脫氨后產(chǎn)生肉桂酸，最后轉化為木質(zhì)素，木質(zhì)素可以提高木質(zhì)化程度，加強細胞壁的機械屏障，防止病原菌入侵[21]。PPO可以催化酚與氧氣反應產(chǎn)生醌，使組織褐變，從而減輕感染，增強抗病能力[22]。此外，POD、PPO還參與木質(zhì)素和植保素的合成代謝[5，22]。SOD、POD、CAT能決定植物脂質(zhì)過氧化作用的敏感性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，用鏈霉菌JD211浸提液處理水稻根系能不同程度地誘導水稻葉片中CAT、POD、PPO、PAL和SOD活性的提升。由此說明，鏈霉菌JD211所產(chǎn)活性物質(zhì)能夠誘導葉片產(chǎn)生CAT、POD、PAL、SOD和PPO。多數(shù)防御酶的產(chǎn)生主要在處理60 h時，說明JD211的活性物質(zhì)主要在后期發(fā)揮作用。但是，目前鏈霉菌JD211浸提液處理根系誘導水稻葉片酶活性的機制還不清楚，可能是直接或者間接地調(diào)節(jié)植保素相關基因的表達，從而使防御酶活性大幅度提升;還有可能是因為JD211浸提液對水稻本身有輕微的毒害作用，而使活性氧暴發(fā)[24]，植物自身通過防御酶保護系統(tǒng)，作出自我調(diào)節(jié)，產(chǎn)生大量防御酶[25-26]。

鏈霉菌JD211浸提液能明顯提高種子發(fā)芽率，處理根系還能誘導抗性酶活性上升，這為鏈霉菌JD211在植物促生及誘導抗病性方面的研究提供了依據(jù)，為植物的生物防治提供了新思路，但是其促生及誘導機制尚不明確，有待通過進一步研究證明。

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