甘藍(lán)型油菜主花序有效角果數(shù)QTL定位和候選基因篩選

耿鑫鑫 曾煥 黃伊雪

摘要：以DH-7-9 （角果數(shù)多）× DH-G-42（角果數(shù)少）雜交后代連續(xù)自交的重組自交系（RIL）的190個(gè)家系為材料，在西寧和武漢2個(gè)環(huán)境下進(jìn)行主花序有效角果數(shù)性狀分析。結(jié)果表明，該RIL群體的主花序有效角果數(shù)表現(xiàn)出連續(xù)變異并且符合正態(tài)分布。利用已構(gòu)建的遺傳連鎖圖，結(jié)合2個(gè)年份2個(gè)環(huán)境下主花序有效角果數(shù)性狀表型數(shù)據(jù)，采用WinQTL Cartographer 2.5軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法（composite interval mapping，簡(jiǎn)稱CIM）進(jìn)行QTL 定位和效應(yīng)估計(jì)。結(jié)果在2個(gè)環(huán)境下共檢測(cè)到6個(gè)與主花序有效角果數(shù)、性狀相關(guān)的QTL，單個(gè)QTL 可解釋的表型變異范圍為7.9%～24.39%。其中qESN-W-C5的貢獻(xiàn)率達(dá)到24.39%，LOD值為12.97，位于C5染色體上，因此視其為該主花序有效角果數(shù)性狀的主效QTLs。將擬南芥中已發(fā)表的角果數(shù)相關(guān)的3個(gè)基因與主效QTL置信區(qū)間對(duì)應(yīng)的油菜基因組上104個(gè)基因進(jìn)行同源比較分析，結(jié)果主效QTL區(qū)域內(nèi)1個(gè)候選基因BnaC05g32840D與擬南芥角果數(shù)基因AT3G19820具有較高的同源性，推測(cè)其為油菜主花序有效角果數(shù)候選基因。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜;主花序有效角果數(shù); QTL定位;候選基因

中圖分類號(hào)： S634.303.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0038-03

油菜是世界上分布最廣、種植歷史悠久的重要油料作物之一。甘藍(lán)型油菜品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高，是我國(guó)油菜生產(chǎn)上的主要栽培類型[1]。菜籽油現(xiàn)在是國(guó)產(chǎn)食用植物油的第一大來(lái)源，在我國(guó)食用油市場(chǎng)中具有舉足輕重的地位。目前，國(guó)內(nèi)油料作物僅提供植物油消費(fèi)總量的40%左右，約60%需進(jìn)口，可見(jiàn)我國(guó)對(duì)國(guó)外的依存度越來(lái)越高，自給總量上嚴(yán)重不足[2]。雙低菜籽餅粕每年為畜牧業(yè)提供超過(guò)600萬(wàn)t的飼料蛋白[3]。加拿大、澳大利亞、韓國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、瑞典、奧地利等國(guó)確立為優(yōu)勢(shì)替代生物質(zhì)能源（生物柴油） 原料作物，其中歐盟目前生產(chǎn)的生物柴油80%來(lái)自油菜原料（生產(chǎn)的油菜籽60%用于生產(chǎn)生物柴油）[4]。因此，提高油菜的產(chǎn)量成為了現(xiàn)在油菜育種的重要目標(biāo)。

高產(chǎn)是作物育種的主要目標(biāo)，產(chǎn)量性狀是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，表現(xiàn)為連續(xù)變異，受環(huán)境的影響較大[5-6]。常規(guī)密度種植的油菜產(chǎn)量是由單株有效角果數(shù)、每角粒數(shù)以及千粒質(zhì)量所構(gòu)成，而這3個(gè)因素間既相互協(xié)同又相互制約。單株有效角果數(shù)是所有主要農(nóng)作物產(chǎn)量構(gòu)成的要素之一，其性狀相對(duì)穩(wěn)定。近年來(lái)隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化的發(fā)展，已經(jīng)打破了常規(guī)密度人工種植油菜的傳統(tǒng)觀念，漸漸轉(zhuǎn)向了機(jī)械化密植油菜的生產(chǎn)過(guò)程。機(jī)械化種植的油菜往往是密度高、分枝少，所以密植油菜主要是通過(guò)提高群體有效角果數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)[7]。已有研究表明，適當(dāng)增加密度可使主序在產(chǎn)量中的比例增加，在75萬(wàn)株/hm2時(shí)主序產(chǎn)量占單株產(chǎn)量的7305%[8]。而且油菜主序的2個(gè)主要性狀主花序長(zhǎng)度和主花序有效角果數(shù)一直以來(lái)都是影響單株產(chǎn)量的主要因素[9]。

綜上所述，單株主花序有效角果數(shù)是影響油菜產(chǎn)量的重要因素。然而，目前為止，關(guān)于單株角果數(shù)數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，簡(jiǎn)稱QTL）等方面的研究卻嚴(yán)重不足。張書(shū)芬等在雙低油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系1141B和雙高恢復(fù)系墾C1構(gòu)建的F2作圖群體中檢測(cè)出的3個(gè)單株角果數(shù)QTLs nsp4、nsp12和nsp2分別位于第4、第12和第2 連鎖群上，分別解釋變異方差的28.22%、11.97% 和7.73%[5]。易斌等利用中油821和保604為親本材料，在相應(yīng)DH系群體中將1個(gè)單株角果數(shù)QTL定位在第4連鎖群上，可解釋 17.42% 的表型變異[10]。孫美玉等以ZY036 × 51070 雜交構(gòu)建的雙單倍體（DH）為材料，在武漢、陽(yáng)邏、青海和襄陽(yáng)3年4點(diǎn)5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)共檢測(cè)到10個(gè)與主花序有效角果數(shù)相關(guān)的QTLs，表型變異是9.33%～31.60%，在染色體A1、A5、C1和C9上的4個(gè)QTLs 都可以在2個(gè)不同的試驗(yàn)中重復(fù)檢測(cè)到[11]。目前有關(guān)油菜單株角果數(shù)的研究基本停留在QTL定位分析水平，由于甘藍(lán)型油菜基因組（AACC，異源四倍體）的復(fù)雜性，單株角果數(shù)相關(guān)基因的克隆與功能研究成果數(shù)量甚少。

本研究以甘藍(lán)型油菜重組自交系（recombinant inbred lines，簡(jiǎn)稱RIL）為材料，對(duì)油菜主花序有效角果數(shù)性狀進(jìn)行QTL定位。根據(jù)QTL置信區(qū)間對(duì)應(yīng)的甘藍(lán)型油菜基因組序列，找出該區(qū)間的全部基因，與擬南芥角果數(shù)相關(guān)基因進(jìn)行同源比對(duì)并篩選候選基因。隨著白菜、甘藍(lán)及甘藍(lán)型油菜全基因組序列陸續(xù)組裝完成[12]，后續(xù)精細(xì)定位和圖位克隆相關(guān)基因及有關(guān)產(chǎn)量調(diào)控的分子機(jī)制研究必將達(dá)到一個(gè)全新的水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以甘藍(lán)型油菜品種DH-7-9（主花序有效角果數(shù)多年多點(diǎn)至少80個(gè)）和DH-G-42（主花序有效角果數(shù)為多年多點(diǎn)至多58個(gè)）為材料進(jìn)行雜交得到F1植株，構(gòu)建了包含190個(gè)株系的重組自交系群體。本試驗(yàn)利用該群體進(jìn)行田間試驗(yàn)、主花序有效角果數(shù)性狀統(tǒng)計(jì)和QTL分析。

1.2 田間試驗(yàn)與主花序有效角果數(shù)性狀考察

將重組自交系群體于2013年9月種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所武漢市武昌區(qū)試驗(yàn)田，2013年5月及2014年5月種植于青海省西寧市青海大學(xué)油菜繁育中心試驗(yàn)田。所有田間試驗(yàn)均按3個(gè)重復(fù)分區(qū)種植，每小區(qū)3 行，行距 40 cm，株距20 cm。按常規(guī)生產(chǎn)方式進(jìn)行田間管理。2014年4月（武漢）、2013年10月（西寧）和2014年10月（西寧）收獲時(shí)期從每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取5～10 株，用于主花序有效角果數(shù)性狀的測(cè)定（每1株油菜植株主花序上能夠結(jié)1粒及以上飽滿種子的角果數(shù)）。

1.3 主花序有效角果數(shù)的QTL定位

在利用F2代群體已構(gòu)建好的遺傳連鎖圖譜[6]的基礎(chǔ)上，進(jìn)行主花序有效角果數(shù)QTL定位。該連鎖圖包含228個(gè)標(biāo)記，20個(gè)連鎖群，圖譜總長(zhǎng)為1 546.6 cM。用WinQTL Cartographer 2.5軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖（CIM）的方法[13-14]定位該重組自交系群體的主花序有效角果數(shù)QTL。選取 1 cM 的步長(zhǎng)，在α=0.05的水平上，利用Permutation檢驗(yàn)法重復(fù)檢驗(yàn)1 000次。將LOD閾值設(shè)定為2.5來(lái)確定QTL在染色體上的位置及數(shù)目。QTL命名參照McCouch等文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)規(guī)則[15]，用SPSS 16.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)分析表型數(shù)據(jù)。

1.4 候選基因篩選

通過(guò)對(duì)TAIR網(wǎng)站（http：//www.arabidopsis.org/）以及已發(fā)表的文章[16]中擬南芥相關(guān)基因功能信息進(jìn)行分析共獲得了3個(gè)角果數(shù)相關(guān)基因。在NCBI上將此3個(gè)擬南芥角果數(shù)相關(guān)基因序列進(jìn)行下載，然后與檢測(cè)到的主效QTL置信區(qū)間對(duì)應(yīng)的甘藍(lán)型油菜基因組序列[12]進(jìn)行BlastN比對(duì)，并進(jìn)行候選基因的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親和RIL群體主花序有效角果數(shù)的表型統(tǒng)計(jì)及與其他農(nóng)藝性狀的相關(guān)性

對(duì)雙親和RIL群體主花序有效角果數(shù)表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，DH-G-42-8和DH-7-9-6主花序有效角果數(shù)差異很大，并且兩親本間具有極顯著性差異（表1）。統(tǒng)計(jì)分析表明，主花序有效角果數(shù)在重組自交系群體中呈現(xiàn)超雙親分離和連續(xù)性分布并且符合正態(tài)分布（圖1），說(shuō)明主花序有效角果數(shù)是由多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀，適合于QTL 分析。

2.2 主花序有效角果數(shù)性狀QTL定位

通過(guò)QTL Cartographer 2.5復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL分析，在武漢和西寧2個(gè)環(huán)境下共檢測(cè)到6個(gè)QTLs與油菜主花序有效角果數(shù)性狀相關(guān)，分別位于A4、A5、A9、C1、C5以及C8染色體上（表2），分別命名為qESN-W-A4、qESN-W-A5、qESN-W-C1、qESN-W-C5、qESN-X-A9和qESN-X-C8。3個(gè)QTLs（分別為qESN-W-A5、qESN-W-C5和qESN-X-C8）的貢獻(xiàn)率都大于10%，其中qESN-W-C5的貢獻(xiàn)率達(dá)到24.39%，LOD值為12.97，因此視其為該主花序有效角果數(shù)性狀的主效QTL（圖2）。

2.3 候選基因篩選

通過(guò)生物信息學(xué)分析，將該主效QTL置信區(qū)間（約0.94 Mb）與甘藍(lán)型油菜基因組序列比對(duì)， 得到共104個(gè)注釋基因。將這些基因與已知的擬南芥3個(gè)角果數(shù)相關(guān)基因（AT1G68725、AT2G33150和AT3G19820）進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主效QTL置信區(qū)間內(nèi)有1個(gè)基因（BnaC05g32840D）與擬南芥角果數(shù)基因具有很高的同源性（88.8%）。擬南芥同源角果數(shù)基因?yàn)锳T3G19820，編碼DWF1/DIM，在油菜素類固醇（BR）的生物合成中催化早期BR前體24-亞基的合成。油菜素類固醇會(huì)影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)，其突變體具有矮化表型，而 DWF1是1個(gè)Ca2+依賴性鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。

3 討論與結(jié)論

本研究所選用的2個(gè)親本材料主花序有效角果數(shù)表型存在極顯著差異，RIL群體表型呈現(xiàn)連續(xù)分布，所選用的甘藍(lán)型油菜遺傳圖譜總長(zhǎng)1 546.6 cM，標(biāo)記間的平均圖距為 6.78 cM，圖譜質(zhì)量可靠。因此，這2個(gè)親本材料及圖譜適合研究主花序有效角果數(shù)相關(guān)遺傳分析。

在國(guó)內(nèi)外的報(bào)道中，孫美玉等以ZY036×51070雜交構(gòu)建的DH群體為材料，3年4點(diǎn)5個(gè)試驗(yàn)共檢測(cè)到10個(gè)與主花序有效角果數(shù)相關(guān)的QTLs，分別位于A1、A3、A5、C1、C4、C6、C9，解釋性狀表型變異是933%～31.60%[11]。高必軍利用中雙4號(hào)×H228構(gòu)建RIL群體，共檢測(cè)到主花序有效角果數(shù)5個(gè)QTLs，分別位于A6、C2、C3連鎖群，解釋性狀變型變異是11.2%～25%[17]。吳建忠檢測(cè)到3個(gè)與主花序有效角果數(shù)相關(guān)的QTLs，分別位于A8和C4上，解釋性狀表型變異507%～9.45%[18]。本研究一共檢測(cè)到6個(gè)主花序有效角果數(shù)QTLs，分別位于A4、A5、A9、C1、C5和C8上，貢獻(xiàn)率在7.9%～24.39%之間，LOD值為3.53～12.97。跟前人的研究結(jié)果相比，本研究在A4、A9、C5和C8新發(fā)現(xiàn)了主花序有效角果數(shù)QTLs。一般認(rèn)為，貢獻(xiàn)率在10%以上的QTL為主效QTL，LOD值越大，QTL的準(zhǔn)確率越高。其中qESN-W-C5的貢獻(xiàn)率達(dá)到24.39%，LOD值為12.97，為所定位的6個(gè)QTLs中的最大值，因此視其為該主花序有效角果數(shù)性狀的主效QTL。

QTL與環(huán)境之間存在密切的關(guān)系。本研究中共檢測(cè)到的6個(gè)QTLs是在2個(gè)年份2個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到的，并沒(méi)有可以在2年相同環(huán)境下同時(shí)檢測(cè)到，產(chǎn)生這些結(jié)果的原因：一是油菜主花序有效角果數(shù)性狀在不同環(huán)境條件下的不穩(wěn)定表達(dá);二是不能重復(fù)檢測(cè)到有可能代表了該環(huán)境條件下的特異表達(dá)基因;三是群體中的個(gè)體可能受到環(huán)境條件的影響程度不一造成的誤差。

通過(guò)對(duì)QTL置信區(qū)間與基因組序列比對(duì)進(jìn)行候選基因預(yù)測(cè)，可以比較簡(jiǎn)便快速地驗(yàn)證QTL定位的準(zhǔn)確性。在C5染色體上的候選區(qū)域與報(bào)道的擬南芥角果數(shù)相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)同源性較高的候選基因BnaC05g32840D，其編碼DWF1/DIM，在油菜素類固醇（BR）的生物合成中催化早期BR前體24-亞基的合成。油菜素類固醇會(huì)影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)，其突變體具有矮化表型，從而調(diào)控植株的有效角果數(shù)數(shù)量。后續(xù)將對(duì)該候選基因進(jìn)行相關(guān)功能驗(yàn)證，并同時(shí)利用主花序有效角果數(shù)主效QTL附近的分子標(biāo)記逐步構(gòu)建目的基因的近等基因系，通過(guò)精細(xì)定位和圖位克隆最終獲得控制該性狀的主效基因。

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