自動(dòng)化抗酸染色系統(tǒng)與手工染片法檢測(cè)性能的比較

袁曉華，左 芳

(1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院/湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院臨床輸血科，湖北黃石 435000;2.武漢科技大學(xué)，湖北武漢 430000)

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的肺部疾病。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2016年全球有1 040.00萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病例，且37.40萬(wàn)人死于MTB[1]。我國(guó)在2011年第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果也顯示，結(jié)核病發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)人，占全球發(fā)病人數(shù)的14.3%[2]；每年因結(jié)核病而死的患者人數(shù)達(dá)13萬(wàn)人，是僅次于印度的世界第二大結(jié)核病高發(fā)國(guó)家[3]，而且人類免疫缺陷病毒(HIV)死亡患者中有1/3是由肺結(jié)核感染引起的[4]。因此，結(jié)核病的早期準(zhǔn)確診斷和治療在防治中起著關(guān)鍵的作用[5]。根據(jù)肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核病的病原學(xué)檢查是結(jié)核病確認(rèn)病例的必備條件[6]。而抗酸染色又是國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院用于檢測(cè)體液或組織中抗酸桿菌的主要方法[7]。同時(shí)抗酸染色檢查還存在操作復(fù)雜、技術(shù)要求高等缺點(diǎn)[8]。因此，黃石市中心醫(yī)院(下稱本院)運(yùn)用自動(dòng)染片系統(tǒng)進(jìn)行抗酸染色，期望達(dá)到與手工抗酸染色一樣的檢測(cè)性能，且能縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢驗(yàn)效率。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年3月本院呼吸內(nèi)科普通住院患者的樣本300例，其中痰樣本233例，肺泡灌洗液67例。

1.2儀器與試劑 Mycol T STAINER自動(dòng)染片系統(tǒng)及配套抗酸染液(批號(hào)2016121301)購(gòu)自上海皓信生物科技有限公司。TXD3細(xì)胞涂片離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。手工抗酸染液試劑盒(批號(hào)415091)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。BX41顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.3方法

1.3.1痰液的樣本處理 每例患者取清晨第一口痰，先用清水漱口，再用力咳出深部痰液0.5～3.0 mL于無菌痰杯內(nèi)，及時(shí)送檢。將專用竹簽從中折斷，用斷處的茬面挑取樣本中的膿樣、干酷樣、血樣等可疑部分，在玻片正面垂直均勻涂抹成10 mm×20 mm卵圓形痰膜。自然干燥后，將玻片5 s內(nèi)置于火焰上烤4次進(jìn)行固定。每個(gè)樣本制片2張。

1.3.2支氣管肺泡灌洗液的樣本處理 收到呼吸內(nèi)科纖支鏡室送檢的支氣管肺泡灌洗液樣本后，將試管輕輕顛倒混勻，取0.9 mL灌洗液加入細(xì)胞涂片離心機(jī)的漏斗中，2 000 r/min,離心10 min，拿出漏斗和濾紙，取下制好的涂片。自然干燥后，同痰樣本一樣固定。每個(gè)樣本制片2張。

1.3.3抗酸染色 手工染片法，首先滴加石炭酸復(fù)紅，染色30 min后水洗，接著用3%鹽酸乙醇脫色2次，每次1 min，2次脫色都用水洗。最后用美藍(lán)復(fù)染0.5 min后水洗，自然干燥，記錄用時(shí)。自動(dòng)染片法，將涂片分批插入自動(dòng)染片機(jī)的轉(zhuǎn)盤中。選擇數(shù)字后按開始鍵，染片機(jī)集染色、加熱、脫色、復(fù)染、干燥于一體，染色完成后記錄用時(shí)。每次手工法或自動(dòng)法染色時(shí)用自制的陽(yáng)性質(zhì)控片進(jìn)行質(zhì)量控制[9]。陽(yáng)性質(zhì)控片預(yù)先準(zhǔn)備，用臨床抗酸桿菌陽(yáng)性程度+++～++++的痰液涂片制作，熱固定后不染色，置于密閉的玻片盒內(nèi)于4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存。

1.3.4閱片 采用雙盲法對(duì)300例樣本的600張玻片用油鏡進(jìn)行鏡檢，根據(jù)《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[10]和上海地區(qū)綜合性醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷操作規(guī)范[9]。觀察300個(gè)視野，鏡下見抗酸桿菌為陽(yáng)性，未見為陰性，只統(tǒng)計(jì)陰、陽(yáng)性，不統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性程度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，采用Fisher′s確切概率法。用成組χ2檢驗(yàn)，P<0.05為兩種染色方法的結(jié)果有相關(guān)性。用配對(duì)資料的McNemar檢驗(yàn)，P<0.05為兩種染色方法的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Kappa檢驗(yàn)來分析兩種染色方法結(jié)果之間的一致性，P<0.01為一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)Kappa值≥0.75時(shí)為一致性好，0.75>Kappa值≥0.4時(shí)為一致性一般，Kappa值<0.4時(shí)為一致性較差。以樣本陽(yáng)性率為對(duì)照組，兩種方法各自的陽(yáng)性率為實(shí)驗(yàn)組，繪制兩種方法的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計(jì)算曲線下面積(AUC)。

2 結(jié) 果

2.1相關(guān)性 233例痰和67例肺泡灌洗液用手工法和自動(dòng)法平行進(jìn)行抗酸染色。手工法檢出痰陽(yáng)性10例，灌洗液陽(yáng)性9例，陽(yáng)性率分別為4.29%和13.43%。自動(dòng)法檢出痰陽(yáng)性9例，灌洗液10例，陽(yáng)性率分別為3.86%和14.93%。成組χ2檢驗(yàn)，痰樣本χ2=163.1，P<0.01，灌洗液樣本χ2=59.26，P<0.01。說明兩種方法的染色結(jié)果有相關(guān)性。

2.2McNemar檢驗(yàn) 檢驗(yàn)結(jié)果痰和灌洗液的P>0.05，為兩種抗酸染色法，結(jié)果的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Kappa檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果痰和灌洗液P<0.01，Kappa值分別為0.835、0.939，為兩種抗酸染色法的一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且一致性好。見表1、2。

表1 兩種方法染色233例痰樣本的結(jié)果

表2 兩種方法染色67例灌洗液樣本的結(jié)果

2.3診斷效能 設(shè)兩種染色方法其中任意一種陽(yáng)性，即認(rèn)定為樣本陽(yáng)性，計(jì)算樣本陽(yáng)性率，痰和灌洗液的樣本陽(yáng)性率分別為4.72%和14.93%。以樣本陽(yáng)性率為對(duì)照組，以兩種方法各自的陽(yáng)性率為實(shí)驗(yàn)組，繪制ROC曲線。手工法和自動(dòng)法的AUC都為0.952，見圖1和表3。說明手工法抗酸染色和自動(dòng)法抗酸染色的診斷效能相同。

圖1 兩種方法染色300例樣本的ROC曲線

2.4用時(shí)比較 300例樣本，手工法平均用時(shí)46 min/n，自動(dòng)法平均用時(shí)12 min/n，自動(dòng)法比手工法節(jié)省74%的耗時(shí)。

表3 兩種方法染色300例樣本的AUC和P值

3 討 論

目前，臨床上已經(jīng)有了幾種新的方法能快速診斷結(jié)核分枝桿菌，如實(shí)時(shí)熒光定性PCR在檢測(cè)低排菌量標(biāo)本時(shí)具有明顯優(yōu)勢(shì)[11]。只是檢測(cè)成本較高，在一些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū)并不適用[12]。抗酸染色檢測(cè)因其較高的特異度、方便快捷的可操作性、生物安全要求低，在診斷分枝桿菌的感染中仍起著重要的臨床作用[13]。有文獻(xiàn)指出，抗酸染色的檢測(cè)性能與多色巢式實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增法(Xpert MTB/RIF)的符合率為90.93%[14]。它作為一個(gè)傳統(tǒng)的方法仍不可丟棄[15]。痰涂片抗酸染色還是判定結(jié)核患者預(yù)后的重要臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)[16]。韓瑩等[17]報(bào)道，近幾年抗酸染色涂片陽(yáng)性患者逐年遞增，提示受感染者有擴(kuò)大的趨勢(shì)。因此，如何準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行抗酸染色檢測(cè)，仍是臨床研究的目標(biāo)。

本文收集了233例痰樣本。另外考慮到普通痰樣本的陽(yáng)性率低，陽(yáng)性樣本太少，因此又收集了67例陽(yáng)性率較高的肺泡灌洗液樣本。使用手工法和自動(dòng)法各染色涂片300張，采用雙盲法進(jìn)行閱片比較。結(jié)果，痰和灌洗液樣本，手工法陽(yáng)性率分別為4.29%和13.43%。自動(dòng)法陽(yáng)性率分別為3.86%和14.93%。成組χ2檢驗(yàn)說明兩種方法的染色結(jié)果有相關(guān)性。McNemar檢驗(yàn)說明兩種方法染色結(jié)果的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Kappa檢驗(yàn)說明兩種方法的一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且一致性好。另外，設(shè)兩種染色方法其中任意一種陽(yáng)性即認(rèn)定為樣本陽(yáng)性，計(jì)算樣本陽(yáng)性率，以樣本陽(yáng)性率為對(duì)照組，手工法和自動(dòng)法的陽(yáng)性率為實(shí)驗(yàn)組，繪制ROC曲線。結(jié)果手工法和自動(dòng)法的AUC都為0.952。兩種方法的ROC曲線完全重合，雖然由于樣本量小的原因，這種重合有著偶然性。但也說明了手工法抗酸染色和自動(dòng)法抗酸染色的診斷效能相同，自動(dòng)化抗酸染色系統(tǒng)可以代替手工抗酸染色法進(jìn)行臨床檢測(cè)，與戴蕓等[18]研究的結(jié)論一致。

自動(dòng)染片系統(tǒng)耗時(shí)短，染色過程僅8～12 min。比手工法節(jié)省74%的用時(shí)。每次可同時(shí)染12或24片，另外，全封閉系統(tǒng)，集加熱、甩干一體，不需要接近水池。比起手工法，使用染料少，污染環(huán)境小。因此，本文認(rèn)為，運(yùn)用自動(dòng)染片系統(tǒng)進(jìn)行抗酸染色，由于其操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，較容易建立標(biāo)準(zhǔn)化，診斷效能和手工法相同，提高了檢驗(yàn)效率，值得臨床推廣。