布美他尼與呋塞米K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對小鼠聽覺功能的影響

錢迪 鄭偉昌 敬光懷 陳翠霞 黃俊煊 湯國棟

（廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科 深圳518109）

鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1（NKCC1）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布于微血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞膜及星形膠質(zhì)細(xì)胞上的離子轉(zhuǎn)運蛋白，不僅對維持神經(jīng)元細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)離子的正常濃度、細(xì)胞容積及維持血腦屏障通透性具有重要的意義，還是參與耳蝸K+循環(huán)生理機制，對聽覺生理功能進(jìn)行維護(hù)的重要功能通道。有相關(guān)研究報道證實，NKCC1 蛋白的低表達(dá)在聽覺功能損傷中發(fā)揮了重要的作用[1]。布美他尼、呋塞米是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的兩類抑制NKCC1 蛋白的K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑。本研究以30 只健康小鼠為研究對象，以對比布美他尼、呋塞米對NKCC1 蛋白的抑制作用，探討布美他尼/呋塞米兩類K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對小鼠聽覺功能的影響。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 選取由我市動物中心提供的30 只健康小鼠為研究對象，小鼠經(jīng)近交自行繁殖培育，均系12 周齡，可保持長時間穩(wěn)定的聽力，體質(zhì)量12～18 g，平均（15.41±4.33）g。采用隨機數(shù)字表法將30 只小鼠分為健康對照組10 例，布美他尼處理組10 例，呋塞米處理組10 例。

1.2 研究方法 （1）聽覺腦干反應(yīng)（ABR）檢測。布美他尼處理組10 只小鼠和呋塞米處理組10 只小鼠，予以三溴乙醇腹腔注射麻醉，用量0.53 mg/g。采用銀針電極，于頭頂正中皮下插入正極，于左耳皮下插入?yún)⒖茧姌O，于右耳皮下插入地極電極。ABR 檢測儀器采用美國產(chǎn)ABR 儀，刺激參數(shù)設(shè)置由電腦產(chǎn)生設(shè)定的短聲、短純音的8、16、32 kHz 為刺激聲。實驗中以能分辨出ABR I 波的最低刺激強度作為ABR 閥值，ABR 檢測3 次，取平均值[2]。（2）K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑處理。布美他尼處理組10 只小鼠于藥物處理前行ABR 檢測，予以腹腔內(nèi)注射麻醉后，給予NKCC1 抑制劑布美他尼注射，注射30 min 后再予以ABR 檢測；停藥3 d，后再次行ABR 檢測。呋塞米處理組10 例小鼠于藥物處理前行ABR 檢測，予以腹腔內(nèi)注射麻醉后給予NKCC1 抑制劑呋塞米注射，注射30 min 后再予以ABR 檢測；停藥3 d，后再次行ABR 檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 健康對照組、布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠ABR 閥值比較 根據(jù)檢測結(jié)果，對比分析健康對照組、布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠ABR 閥值。

1.3.2 布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠給藥前后及恢復(fù)后ABR 閥值比較 根據(jù)檢測結(jié)果，對比分析布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠給藥前后及恢復(fù)后ABR 閥值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料用表示，采用t 檢驗。多組間數(shù)據(jù)的簡單比較用方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠ABR 閥值比較 給藥前三組平均ABR 閥值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.103，P=0.925）；給藥后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均高于健康對照組（t=7.142、8.261，P=0.041、0.039），且布美他尼處理組平均ABR 閥值高于呋塞米處理組（t=7.563，P=0.040）。見表1。

表1 三組小鼠ABR 閥值比較（dB SPL

表1 三組小鼠ABR 閥值比較（dB SPL

組別 n 給藥前 給藥后健康對照組1022.34±4.25-布美他尼處理組1023.45±5.2165.20±10.41呋塞米處理組1023.14±5.3250.35±8.56

2.2 布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠給藥前后及恢復(fù)后ABR 閥值比較 停止給藥恢復(fù)后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均低于給藥后（t=8.284、8.556，P=0.037、0.036），與給藥前接近。見表2。

表2 布美他尼、呋塞米處理組給藥前后及恢復(fù)后ABR 閥值比較（dB SPL

表2 布美他尼、呋塞米處理組給藥前后及恢復(fù)后ABR 閥值比較（dB SPL

組別 n 給藥前 給藥后 停止給藥恢復(fù)后布美他尼處理組1023.45±5.2165.20±10.4127.45±6.26呋塞米處理組1023.14±5.3250.35±8.5625.15±5.54

3 討論

NKCC1 是Na+-K+-Cl-內(nèi)向共轉(zhuǎn)運體（Na、K 濃度梯度共同驅(qū)動），與K+-Cl-外向共轉(zhuǎn)運體（鉀濃度梯度驅(qū)動）同屬于氯偶聯(lián)的共轉(zhuǎn)運體家族，市面上針對NKCC 靶點的藥物開發(fā)主要集中在心腦血管疾病治療領(lǐng)域，包括高血壓、水腫以及心力衰竭等[3]。近年來，隨著臨床醫(yī)學(xué)及動物實驗對耳聾疾病病理機制研究的不斷深入，諸多文獻(xiàn)研究報道強調(diào)NKCC1 蛋白的低表達(dá)在聽覺功能損傷中發(fā)揮了重要的作用[4]。臨床上，關(guān)于NKCC1 在聽覺功能中的作用尚無確切結(jié)論，但國內(nèi)外一致持有如下觀點：NKCC1 可通過對內(nèi)向性Na+濃度梯度的利用以1 Na+:1K+:2Cl-的比例將離子轉(zhuǎn)運至邊緣細(xì)胞，而經(jīng)邊緣細(xì)胞頂膜上的KCNQ1 通道將K+分泌至淋巴，進(jìn)而形成EP；同時分泌至耳蝸內(nèi)淋巴中的K+經(jīng)基底膜毛細(xì)胞與螺旋韌帶間的通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運，再次進(jìn)入邊緣細(xì)胞，以此循環(huán)，構(gòu)成耳蝸K+循環(huán)機制，進(jìn)而對聽覺功能進(jìn)行維持[5]。布美他尼/呋塞米兩類K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對NKCC1 蛋白的表達(dá)具有顯著的抑制作用，這兩類藥物所造成的聽力損傷是雙側(cè)對稱性，這主要是因為該兩類藥物與內(nèi)耳毛細(xì)胞膜接觸，增加了內(nèi)耳毛細(xì)胞的通透性，而袢利尿劑以較高的濃度進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，引起了毛細(xì)胞的損傷。

褚漢啟等的研究中應(yīng)用NKCC1 抑制劑呋塞米對CBA/CaJ 和Castel 兩種鼠系進(jìn)行了離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制-聽覺實驗，并對小鼠ABR 閾值進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示小鼠經(jīng)呋塞米注射30 min 后，ABR 閾值顯著高于注射前（P＜0.01），且顯著高于正常對照組（P＜0.01），提示呋塞米對NKCC1 具有顯著的抑制作用，會對小鼠聽覺功能造成影響，這與本次研究結(jié)果一致[6]。王橋生等按隨機數(shù)字法將SD 大鼠分成假手術(shù)組、腦缺血組和布美他尼組，結(jié)果顯示大鼠予布美他尼干預(yù)后，NKCC1 表達(dá)均顯著下降（P＜0.05），證實布美他尼可通過下調(diào)NKCC1 表達(dá)水平改善缺血性腦水腫和神經(jīng)功能[7]。而目前尚無關(guān)于布美他尼/呋塞米兩類K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對小鼠聽覺功能及NKCC1 抑制作用的對比研究文獻(xiàn)報道。本研究采用對照研究的方法，分別對健康對照組、布美他尼處理組、呋塞米處理組小鼠的ABR 進(jìn)行檢測，結(jié)果給藥后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均高于健康對照組（P＜0.05），即經(jīng)布美他尼、呋塞米兩類K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑處理后，小鼠聽覺功能明顯損傷。經(jīng)藥物處理后，布美他尼處理組平均ABR 閥值高于呋塞米處理組（P＜0.05），停止給藥恢復(fù)后，布美他尼處理組、呋塞米處理組平均ABR 閥值均低于給藥后（P＜0.05），與給藥前接近，提示布美他尼對NKCC1 的抑制作用高于呋塞米，對小鼠聽覺功能的損傷影響高于呋塞米。

綜上所述，布美他尼K+轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑對NKCC1 的抑制作用高于呋塞米，對小鼠聽覺功能的損傷影響高于呋塞米。