瑞芬太尼通過miR-519d-3p/STAT3對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

孫成成, 劉 宇, 胡旭明

孫成成, 劉宇, 義烏市中心醫(yī)院麻醉科 浙江省義烏市 322000

胡旭明, 浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院麻醉科 浙江省杭州市 310016

核心提要: 瑞芬太尼體外處理胃癌(gastric cancer, GC)細(xì)胞, 可抑制GC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 并誘導(dǎo)GC細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)上調(diào). 功能驗證發(fā)現(xiàn), STAT3是miR-519d-3p的靶基因, 而抑制miR-519d-3p表達(dá)或過表達(dá)STAT3均能逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的作用.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)發(fā)病率和死亡率在中國惡性腫瘤中均居第3位, 是威脅中國居民生命健康的重大疾病之一[1]. 外科手術(shù)治療是GC根治的唯一方式, 阿片類藥物廣泛用于腫瘤手術(shù)全麻及術(shù)后自控鎮(zhèn)痛, 也是癌痛治療的重要部分, 此外有研究表明, 阿片類藥物可通過不同機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[2-4]. 瑞芬太尼是一種高效阿片受體激動劑, 已有研究報道瑞芬太尼可抑制結(jié)腸癌、肝癌、肺腺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5-7].但目前瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制還不清楚. 本研究以GC SGC7901細(xì)胞為研究對象, 分析瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響, 并初步探討其潛在作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料 GC細(xì)胞株SGC7901由中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心提供; 胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司); 注射用鹽酸瑞芬太尼(Remifentanil, 湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司, 批號6120903); LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(北京索萊寶科技有限公司); MTT試劑和二甲基亞砜(上海生工生物工程有限公司); Trizol試劑和RIPA裂解液(Invitrogen公司).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染: 將GC細(xì)胞SGC7901培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基, 放于37 ℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 第2 d更換培養(yǎng)液, 待細(xì)胞長至80%作用融合時, 用0.25%胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng).

取對數(shù)生長期GC SGC7901細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并按2×105個/孔接種于96孔板, 待細(xì)胞長至60%左右融合時, 使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑分別將miRNA-mimics、miR-519d-3p-mimics、miRNA-inhibitor、miR-519d-3p-inhibitor、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-STAT3轉(zhuǎn)染至細(xì)胞, 并分別記為miR-NC組、miR-519d-3p組、anti-miR-NC組, anti-miR-519d-3p組、pcDNA組,pcDNA3-STAT3組.

1.2.2 MTT實驗: 取對數(shù)生長期的GC SGC7901細(xì)胞,以5×104個/孔接種于24孔板中培養(yǎng)過夜, 分別加入Remifentanil濃度1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、3.5 mg/mL、4 mg/mL處理, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時, 每孔分別加入20 μL MTT溶液孵育4 h, 吸去上清, 每孔分別加入150 μL二甲基亞砜反應(yīng)10 min. 酶標(biāo)儀下測定各孔490 nm波長處吸光度(A)值. 同樣方法檢測各轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞的增殖活性.

1.2.3 流式細(xì)胞儀實驗: 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以1×106個/mL的密度加入流式管中, 1000×g離心5 min棄上清,使用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次后1×Binding Buffer重懸細(xì)胞, 采用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況.首先加入Annexin V-FITC 5 μL混勻室溫避光染色15 min,再加入PI染色液10 μL冰浴下染色5 min, 放入流式細(xì)胞儀上檢測并計算細(xì)胞凋亡率.

1.2.4 qRT-PCR實驗: 收集細(xì)胞加入Trizol試劑抽提總RNA, 紫外分光光度計下測定RNA樣品質(zhì)量和濃度, 以RNA為模板使用Takara逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA, 以cDNA為模板、U6為內(nèi)參基因使用ABI染料法實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng). 結(jié)果采用2-△△Ct法計算miR-519d-3p相對表達(dá)水平.

1.2.5 Western blot實驗: 收集細(xì)胞加入RIPA裂解液提取總蛋白, BCA法測定蛋白樣品濃度并定量, 將蛋白樣品按1:5比例與上樣緩沖液混合, 放入100 ℃水浴鍋中變性3 min, 采用SDS-PAGE分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,并放入封閉液中封閉1 h. TBST溶液洗膜, 加入稀釋的STAT3抗體和GAPDH抗體一抗4 ℃下過夜, 洗膜, 加入相應(yīng)二抗室溫放置2 h. 洗膜, 放入ECL顯色液中顯色, 紫外凝膠成像儀中曝光、拍照, 應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值, 以GAPDH為對照計算STAT3蛋白相對表達(dá)水平.

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒? 為證實miR-519d-3p靶向STAT3, 本研究分別構(gòu)建STAT3的3’UTR和突變3’UTR的熒光素酶報告基因載體, 然后分別與miRNA-mimics、miR-519d-3p-mimics共轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞, 使用Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性.

統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0用于實驗數(shù)據(jù)分析, 計量數(shù)據(jù)用mean±SD表示, 多組間比較采用單因素方差分析檢驗, 兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗, 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 Remifentanil對GC細(xì)胞SGC 7901增殖及對miR-519d-3p表達(dá)的影響 與Con組比較, 培養(yǎng)48 h和72 h時2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、3.5 mg/mL、4 mg/mL Remifentanil處理的GC SGC7901細(xì)胞增殖活性明顯降低(P＜0.05), 2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、3.5 mg/mL、4 mg/mL Remifentanil處理的GC SGC7901細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)水平逐漸升高(P＜0.05). 說明Remifentanil能夠抑制GC細(xì)胞增殖, 并促進(jìn)GC細(xì)胞miR-519d-3p表達(dá).根據(jù)以上實驗結(jié)果, 選用對細(xì)胞抑制效果較為明顯的Remifentanil(4 mg/mL)做后續(xù)實驗(圖1).

2.2 Remifentanil對GC細(xì)胞SGC7901凋亡影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果, Con組、Remifentanil組GC SGC7901細(xì)胞凋亡率分別為7.18%±1.24%、21.98%±5.37%. 與Con組比較, Remifentanil組GC細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05).說明Remifentanil能夠誘導(dǎo)GC細(xì)胞凋亡(圖2).

2.3 過表達(dá)miR-519d-3p對GC細(xì)胞SGC7901增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較, miR-519d-3p組GC SGC7901細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05), 培養(yǎng)48 h和72 h時細(xì)胞增殖活性明顯降低(P＜0.05); miR-NC組和miR-519d-3p組GC細(xì)胞凋亡率分別為7.23%±1.31%、17.94%±4.38%, miR-519d-3p組細(xì)胞凋亡率明顯高于miR-NC組(P＜0.05). 說明過表達(dá)miR-519d-3p能夠抑制GC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖3).

2.4 抑制miR-519d-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)Remifentanil對GC細(xì)胞SGC7901增殖、凋亡的作用 與REM+anti-miR-NC組比較, REM+anti-miR-519d-3p組GC SGC7901細(xì)胞中miR-519d-3p相對表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05), 培養(yǎng)48 h和72 h時細(xì)胞增殖活性明顯升高(P＜0.05); REM+antimiR-NC組和REM+anti-miR-519d-3p組GC細(xì)胞凋亡率分別為22.37%±4.96%、14.08%±3.74%, REM+anti-miR-519d-3p組細(xì)胞凋亡率明顯低于REM+anti-miR-NC組(P＜0.05)(圖4).

2.5 STAT3為miR-519d-3p的靶基因 生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-519d-3p能夠與STAT3的3’UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合(圖5A). 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示(圖5B), 過表達(dá)miR-519d-3p抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄活性, 而將STAT3的3’UTR區(qū)突變后miR-519d-3p的抑制作用消失. Western blot結(jié)果表明(圖5C和D), 過表達(dá)miR-519d-3p的GC細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05), 而抑制miR-519d-3p表達(dá)的GC細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05). 說明STAT3是miR-519d-3p的靶基因.

2.6 過表達(dá)STAT3能逆轉(zhuǎn)Remifentanil對GC細(xì)胞SGC 7901增殖、凋亡的作用 與REM+pcDNA組比較,REM+pcDNA-STAT3組GC SGC7901細(xì)胞中STAT3蛋白相對表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05), 培養(yǎng)48 h和72 h時細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)(P＜0.05); REM+pcDNA組和REM+pcDNA-STAT3組GC細(xì)胞凋亡率分別為19.17%±3.02%、13.76%±2.88%, REM+pcDNA-STAT3組細(xì)胞凋亡率明顯低于REM+pcDNA組(P＜0.05)(圖6).

圖1 Remifentanil對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖及對miR-519d-3p表達(dá)的影響.

圖2 Remifentanil對胃癌細(xì)胞凋亡影響.

圖3 過表達(dá)miR-519d-3p對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、凋亡的影響.

3 討論

腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)[8]. 阿片類藥物是腫瘤治療中重要的麻醉鎮(zhèn)痛藥, 近年來越來越多的研究證實其在腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡中起重要作用. 張海芳等[9]報道芬太尼可使GC細(xì)胞周期阻滯在G1期, 并顯著抑制CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá), 進(jìn)而抑制GC細(xì)胞增殖. 瑞芬太尼的親和力和半衰期優(yōu)于比芬太尼, 唐優(yōu)仕等[10]報道瑞芬太尼可通過抑制Akt通路, 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá), 發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用. 本研究參考唐優(yōu)仕等方法,用不同濃度瑞芬太尼處理GC SGC7901和BGC823細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼明顯抑制GC細(xì)胞增殖, 其中瑞芬太尼濃度為4 mg/mL時抑制作用最明顯, 且GC SGC7901細(xì)胞對瑞芬太尼相對較為敏感.

圖4 抑制miR-519d-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)Remifentanil對細(xì)胞SGC 7901增殖、凋亡的作用.

圖5 miR-519d-3p靶向調(diào)控STAT3.

microRNA(miRNA)是腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]. 據(jù)報道[12], miR-519d在GC組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào), 與GC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān), 且是GC不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子. 功能分析表明, 抑制miR-519d表達(dá)能促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲, 而過表達(dá)miR-519d則顯著抑制GC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化, 抑制腫瘤生長. 提示miR-519d在GC中起腫瘤抑制劑作用. 本研究發(fā)現(xiàn), 瑞芬太尼可誘導(dǎo)GC細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)升高. 體外構(gòu)建過表達(dá)miR-519d-3p的GC細(xì)胞表明miR-519d-3p能夠抑制GC細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 而抑制miR-519d-3p表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響. 說明瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響與miR-519d-3p表達(dá)有關(guān).

圖6 過表達(dá)STAT3能逆轉(zhuǎn)Remifentanil對胃癌細(xì)胞SGC 7901增殖、凋亡的作用.

Li等[13]報道, miR-519d-3p可通過靶向LIM結(jié)構(gòu)域激酶1抑制乳腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移. 另有研究表明[14],miR-519d-3p在GC組織中低表達(dá)與GC組織分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān), 并證實過表達(dá)miR-519d-3p延緩GC細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換, 抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá), 并靶向下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤6表達(dá), 而發(fā)揮抑制GC細(xì)胞增殖和侵襲的作用. 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)是細(xì)胞中參與生長因子、細(xì)胞因子等應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白, 負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等, 其持續(xù)活化與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15,16]. 本研究通過生物信息學(xué)軟件和相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)GC細(xì)胞中miR-519d-3p靶向負(fù)調(diào)控STAT3的表達(dá), 與Deng等[17]在乳腺癌中的研究結(jié)果基本一致. 進(jìn)一步分析結(jié)果, 過表達(dá)STAT3也可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響. 推測瑞芬太尼可能通過誘導(dǎo)GC細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá), 進(jìn)而靶向抑制STAT3的表達(dá), 發(fā)揮抑制GC細(xì)胞增殖和凋亡的作用.

綜上所述, 瑞芬太尼能夠有效抑制GC細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 其作用機(jī)制可能與調(diào)控GC細(xì)胞中miR-519d-3p/STAT3表達(dá)有關(guān). 本研究為瑞芬太尼在GC治療中的應(yīng)用提供了實驗參考, 但其在GC中是否存在其它作用途徑尚需進(jìn)一步研究.

文章亮點(diǎn)

實驗背景

研究表明, 阿片類藥物不僅用于腫瘤手術(shù)麻醉及術(shù)后鎮(zhèn)痛, 而且對腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為具有一定抑制作用.瑞芬太尼作為一種高效阿片受體激動劑, 已有報道瑞芬太尼可抑制結(jié)腸癌、肝癌、肺腺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡. 但目前瑞芬太尼對胃癌(gastric cancer, GC)細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚.

實驗動機(jī)

本研究分析瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響, 并進(jìn)一步探討其潛在分子作用機(jī)制, 對瑞芬太尼在GC治療中應(yīng)用具有指導(dǎo)意義.

實驗?zāi)繕?biāo)

闡明瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制, 旨在為瑞芬太尼在臨床GC治療中的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ).

實驗方法

體外培養(yǎng)人GC細(xì)胞SGC7901, 分別采用MTT實驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響, 采用RT-qPCR實驗檢測不同濃度瑞芬太尼對GC細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)的影響. 構(gòu)建抑制表達(dá)miR-519d-3p的GC細(xì)胞, 觀察瑞芬太尼對抑制miR-519d-3p表達(dá)后的GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響. 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSTAT3是否是miR-519d-3p的靶基因. 構(gòu)建過表達(dá)STAT3的GC細(xì)胞, 觀察瑞芬太尼對過表達(dá)STAT3的GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響.

實驗結(jié)果

瑞芬太尼能夠有效抑制GC細(xì)胞增殖, 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)GC細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)上調(diào). 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-519d-3p能夠靶向抑制STAT3的表達(dá).抑制miR-519d-3p表達(dá)或過表達(dá)STAT3均能逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響作用.

實驗結(jié)論

瑞芬太尼具有抑制GC細(xì)胞增殖, 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用. 其分子作用機(jī)制之一是促進(jìn)GC細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá), 進(jìn)而靶向抑制STAT3的表達(dá).

展望前景

本研究通過體外實驗, 闡明了瑞芬太尼對GC細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其潛在分子機(jī)制, 對臨床GC治療具有一定指導(dǎo)意義. 下一步將構(gòu)建GC大鼠模型, 研究瑞芬太尼在體內(nèi)對GC細(xì)胞的作用及其最佳作用濃度.