高效液相色譜法測定甜菜堿的含量

張倩茹　尹蓉　殷龍龍　王賢萍　孫慧英　梁志宏

摘 要：選用Supersil SCX 5μm高效液相色譜柱，柱溫30℃，流動相為0.01M甲酸銨-甲醇∶水85∶15（v/v）溶液，流速1.0mL/min，建立了高效液相色譜-示差檢測器測定甜菜堿的方法。該方法線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為y=108284x-23952，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，甜菜堿的加標(biāo)回收率為99.45%～100.63%，為甜菜堿的檢測提供了一種快速高效的方法，且靈敏度高，重復(fù)性好，簡便易行。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;甜菜堿;甲醇

中圖分類號 S566.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）15-0011-03

Determination of Betaine by High Performance Liquid Chromatography

Zhang Qianru1 et al.

（1Institute of Pomology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Shanxi Key Laboratory of Germplasm Improvementand Utilization in Pomology，Taiyuan 030031，China）

Abstract：An high performance liquid chromatography method for determination of betaine was built up. The Supersil SCX 5μm high performance liquid chromatography column was selected，the column was set at 40℃，using 0.01mol/L ammonium formate methanol∶water 85∶15（v/v） solution as mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. The results showed that the method has a good linear relationship and high sensitivity，y=108284x-23952，R2=0.9994，the recovery rate between 99.45%-100.63%.This method provided a fast and efficient for determination of betaine，which was sensitive repeatable and easy to use.

Key words：High Performance Liquid Chromatography;Betaine;Methanol

甜菜堿19世紀(jì)在歐洲被發(fā)現(xiàn)，其功效在20世紀(jì)70年代被認(rèn)識。因其是動植物代謝的中間產(chǎn)物，所以動植物體內(nèi)都含有甜菜堿，其中全谷物、菠菜、蝦和甜菜含有豐富的甜菜堿[1-3]。人體中幾乎所有組織中都含有甜菜堿，肝臟、腎臟和睪丸中的濃度最高，血液質(zhì)粒中的含量在20～70μmol/L，是人體所需重要的營養(yǎng)物質(zhì)[4]。甜菜堿在哺乳動物的生理和其他方面都起著重要作用，腎臟、肝臟和其他器官都含有表達(dá)特定運輸系統(tǒng)的細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)其從血液中對甜菜堿的攝取和積累[5-6]。甜菜堿可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高冷適應(yīng)，作為冷凍保護(hù)劑，在甲硫氨酸等循環(huán)中作甲基供體，保護(hù)線粒體，提高脂肪組織胰島素敏感性，增加牲畜的瘦肉量，改變細(xì)胞體積調(diào)節(jié)滲透壓;作為飼料添加劑用于鮭魚等養(yǎng)殖，能提高植物耐鹽力及光合作用能力[1，7-11]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，現(xiàn)階段對甜菜堿含量的測定方法有滴定法、分光光度計比色法、離子色譜法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀法等。周暢[12]等采用比色法測定海產(chǎn)品中甜菜堿含量，吳燕[13]等采用比色法測定枸杞子中甜菜堿含量，楊雪[14]等用非水滴方法和離子色譜法比較了5種產(chǎn)品的甜菜堿含量，吳英鍵[15]采用高效液相色譜-電噴霧檢測器法測定枸杞子中甜菜堿的含量，張弦飛[16]等采用超高效合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定枸杞中甜菜堿含量，張文昔[17]等也采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了海藻肥中的甜菜堿。

一般在檢測甜菜堿時，應(yīng)根據(jù)實際情況結(jié)合實驗室條件和測定要求選擇適當(dāng)方法。滴定法、分光光度計比色法成本低，操作簡單，樣品前處理相對容易，對實驗室設(shè)備要求較低，但分析時間較長且重復(fù)性、準(zhǔn)確性差，適合小型企業(yè)或農(nóng)戶。離子色譜法、超高效液相色譜法、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)儀法，專屬性較強(qiáng)、檢測速度快、靈敏度高，但樣品前處理復(fù)雜，且對試驗人員技術(shù)及操作條件控制要求高，儀器設(shè)備昂貴，適合大型企業(yè)、科研院所和高校。鑒于甜菜堿在我國農(nóng)業(yè)、飼料工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中的作用本研究采用高效液相色譜-示差檢測器法測定甜菜堿，探索此方法測定甜菜堿含量的可行性和準(zhǔn)確率，旨在選擇一種同時兼具測試準(zhǔn)確、靈敏度高但成本較低且操作簡單的方法，以期對飼料、植物等中甜菜堿的檢測及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 甜菜堿（標(biāo)準(zhǔn)品），甲醇（色譜純，默克），甲酸銨（色譜純，國藥），屈臣氏純凈水。超聲波清洗器（KQ-250DB型，昆山市超聲波儀器有限公司）;e2695高效液相色譜系統(tǒng)（包括：2414型示差折光檢測器;柱溫箱;Empower色譜工作處理站，Waters公司）;圓形固相萃取裝置（USE-12C型，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）;SCX SPE固相萃取小柱（硅膠為基質(zhì)的強(qiáng)陽離子交換萃取柱，鍵合有苯磺酸官能團(tuán)）。

1.2 色譜條件設(shè)置 色譜柱：Supersil SCX 300A 5μm陽離子交換柱;流動相：0.01M甲酸銨-甲醇∶水85∶15（v/v）溶液（稱取0.63g的甲酸銨，置于1000mL容量瓶中，加入150mL純凈水，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，超聲后過0.45μm無機(jī)濾膜）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量10μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制0.00（空白）、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00mg/mL的甜菜堿溶液，設(shè)定自動進(jìn)樣程序，進(jìn)樣量10μL，每一濃度重復(fù)3次，在上述條件下，甜菜堿大約在5.096min左右出峰，色譜圖見圖1，測定甜菜堿峰面積，取同一濃度下3次峰面積平均值，以甜菜堿濃度為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的甜菜堿峰面積為縱坐標(biāo)，繪制甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理;采用SPSS 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件 通過調(diào)整流動相成分比，比較出峰時間與峰型，最終確定適合的的流動相成分及比例。試驗選擇0.01M甲酸銨-甲醇-水95∶5（v/v）、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25溶液，在0.2～1.0mL/min范圍內(nèi)改變流動相流速，在25～50℃范圍內(nèi)改變柱溫，進(jìn)樣量10μL，進(jìn)行色譜條件的組合試驗。結(jié)果表明：流動相中甲醇比例越高，出峰時間越早，分離效果越差，因此選擇0.01M甲酸銨-甲醇∶水85∶15（v/v），流動相為1.0mL/min，柱溫30℃，測定的準(zhǔn)確度高、被測組分分離效果最好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖2可知，高效液相色譜-示差檢測器法測定甜菜堿含量具有良好的線性關(guān)系，高效液相色譜-示差檢測器法測定甜菜堿的回歸方程為：y=108284x-23952，R2=0.9994。

2.3 精密度和回收率 在選定的條件下，對1份甜菜堿含量為10.00mg/mL的樣品進(jìn)行加標(biāo)測定，甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量分別為2.00mg/mL、4.00mg/mL、6.00mg/mL，每份實際樣品分別進(jìn)行5次重復(fù)測定，計算甜菜堿的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率，測定結(jié)果見表1。

標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，說明采用高效液相色譜-示差檢測器測定甜菜堿數(shù)據(jù)的偏離平均值就越少，穩(wěn)定性，重復(fù)性越高。由表1可以看出，所測結(jié)果與理論值偏差較小，標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值為0.29%，回收率接近100%，說明采用高效液相色譜-示差檢測器測定甜菜堿含量穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確度較高，完全能夠滿足試驗要求。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-示差檢測器測定甜菜堿含量的方法。試驗結(jié)果表明，選用Supersil SCX 5μm陽離子交換柱測定甜菜堿，重現(xiàn)性好，精確度高，操作簡單快捷，成本低，適用于甜菜堿的測定。該色譜方法基線平穩(wěn)，峰形、線性關(guān)系良好，回收率及標(biāo)準(zhǔn)差平均值分別為100.18%和0.20%。而高氯酸滴定法、紫外光譜法[12，13]對甜菜堿含量測定的回收率和標(biāo)準(zhǔn)差都大于高效液相色譜-示差檢測器測定，離子色譜法、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀法，雖然精密度和穩(wěn)定性高，但設(shè)備昂貴，對操作人員技術(shù)要求高。因此，采用高效液相色譜-示差檢測器測定方法，是測定飼料、植物等中甜菜堿含量的理想方法，并能夠有效進(jìn)行質(zhì)量控制。

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（責(zé)編：王慧晴）