三氧化二砷對(duì)前列腺癌移植瘤GSTP1基因去甲基化作用的研究

常 琳

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院ICU， 河南省鄭州市 450000

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，死亡率亦較高[1]；但隨著生活方式的改變、人口老齡化及腫瘤篩查的普及，前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率亦呈直線上升，且發(fā)現(xiàn)時(shí)多已是中晚期，因此其發(fā)病機(jī)制逐漸引起重視。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶作為一種多功能二聚體同工酶家族，具有催化解毒的作用，可將致癌物排出，其包含A、M、T、P四個(gè)亞家族，而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)就是P亞家族中的一員，它在抗腫瘤、抗細(xì)胞損傷的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2]。有研究表明，GSTP1基因甲基化的異常致使GSTP1基因失去活性,而這種失活對(duì)肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都起著至關(guān)重要的作用。隨著研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化的過(guò)程是可逆的，可通過(guò)相關(guān)手段使DNA去甲基化而恢復(fù)表達(dá)，成為了腫瘤治療的新方法[3]。本文旨在探討三氧化二砷(As2O3)對(duì)前列腺癌移植瘤GSTP1基因的甲基化狀態(tài)的影響及可能相關(guān)的機(jī)制，為前列腺癌治療的研究提供新的思路、方向及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人前列腺癌細(xì)胞株DU145于中科院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買；30只Balb/c(nu-/nu-)雄性裸鼠于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買；動(dòng)物RNA、DNA提取試劑盒、甲基化修飾試劑盒分別于北京鼎國(guó)昌盛、Epigentek公司購(gòu)買；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Thermo Scientific公司；兔抗GSTP1單克隆抗體、免疫組化SP-0023試劑盒均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠模型建立：前列腺癌DU145細(xì)胞用PRMI-1640培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)箱(T 37℃,5% CO2)中常規(guī)培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加胰酶消化液消化成單細(xì)胞懸液，注射于接種裸鼠的右前肢靠近腋窩處的背部皮下，1周左右時(shí)間接種腫瘤細(xì)胞部位開始呈現(xiàn)硬結(jié)改變，隨時(shí)間逐漸長(zhǎng)大，即成功建立前列腺癌移植瘤的模型，100%成瘤。

1.2.2 模型的分組、處理：2周后去除瘤體過(guò)大或過(guò)小的裸鼠，留下大小一致、形狀規(guī)則的28只裸鼠，隨機(jī)分為4組，每組7只(剪耳做標(biāo)記)：給藥前稱重，每組均給藥3周?？瞻讓?duì)照組：腹腔注射：0.2ml生理鹽水+灌胃：0.2ml三蒸水，1次/d；比卡魯胺組：腹腔注射：0.2ml生理鹽水+灌胃：0.2ml比卡魯胺(23mg/kg)，1次/d；As2O3組：腹腔注射：0.2ml As2O3(3mg/kg)+灌胃：0.2ml三蒸水，1次/d；As2O3+比卡魯胺組：腹腔注射：0.2ml As2O3(3mg/kg)+灌胃：0.2ml比卡魯胺(23mg/kg)，1次/d。用藥結(jié)束后的第2天脫臼處死裸鼠，并將腫瘤組織完整的解剖處理，稱重，并放入液氮中保存，裸鼠尸體由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心集中處理。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)：根據(jù)總RNA提取試劑盒提供的步驟來(lái)提取總RNA ,然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的步驟吸取1μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,取50μl反應(yīng)體系(2×Taq PCR Green Mix 25μl、cDNA 3μl、引物F 1μl、引物R 1μl、DDH2O 20μl)進(jìn)行RT-PCR。β-actin 引物序列：F:5’-AGGCATTGTGTGATGGACTCCG-3’;R:5’-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3’,產(chǎn)物大小301bp；GSTP1 引物序列：F:5’-TCCAATACCATCCTGCGTCAC-3’;R:5’-ATCCTTGCCCGCCTCATAG-3’,產(chǎn)物大小156bp；冰上操作，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min、94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物放置4℃保存。取5μl產(chǎn)物，加樣于2.0%瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳，并觀察分析凝膠成像。

1.2.4 MSP檢測(cè)：據(jù)DNA提取試劑盒步驟提取總DNA,取4μg DNA按DNA甲基化修飾試劑盒步驟操作，得到甲基化修飾的DNA;50μl反應(yīng)體系(2×Taq Master Mix 25μl、DNA 模板1μl、引物F 2μl、引物R 2μl、DDH2O 20μl)中進(jìn)行MSP；uGSTP1引物序列：F:5’-GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3’;R:5’-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3’,產(chǎn)物大小97bp;mGSTP1 引物序列：F:5’-TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC-3’;R:5’-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’,產(chǎn)物大小93bp。冰上操作，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min、94℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸2min，產(chǎn)物于4℃保存。取5μl產(chǎn)物，同樣于2.0%瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳，觀察分析凝膠成像。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)：按免疫組織試劑盒提供的步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)四組移植瘤組織GSTP1蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的比較采用方差分析，α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。以P<α為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 As2O3誘導(dǎo)GSTP1 mRNA 的重新表達(dá) 空白對(duì)照組和比卡魯胺組無(wú)目的基因條帶出現(xiàn)，而As2O3組和As2O3+比卡魯胺組均出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶(156bp)；分析兩組基因條帶的灰度值(采用Image J軟件系統(tǒng))：As2O3組為：0.852；As2O3+比卡魯胺組為：0.834；兩組條帶灰度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 As2O3對(duì)四組標(biāo)本mRNA的作用

1-空白對(duì)照組；2-比卡魯胺組；3-As2O3組；4-As2O3+比卡魯胺組

2.2 As2O3對(duì)GSTP1 DNA 的去甲基化作用 GSTP1甲基化陽(yáng)性條帶為93bp，去甲基化陽(yáng)性條帶為97bp，空白對(duì)照組和比卡魯胺組出現(xiàn)明顯的甲基化陽(yáng)性條帶，未出現(xiàn)明顯的去甲基化陽(yáng)性條帶；而As2O3組和As2O3+比卡魯胺組均出現(xiàn)明顯的去甲基化陽(yáng)性條帶；分析兩組去甲基化條帶的灰度值(采用Image J軟件系統(tǒng))：As2O3組為：0.685；As2O3+比卡魯胺組為：0.702；兩組的去甲基化條帶灰度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 As2O3對(duì)四組標(biāo)本DNA的去甲基化作用

m-甲基化條帶，u-去甲基化條帶；1-空白對(duì)照組；2-比卡魯胺組；3-As3O2組；4-As3O2+比卡魯胺組

2.3 As2O3誘導(dǎo)GSTP1蛋白的重新表達(dá) 400倍顯微鏡下，隨機(jī)選擇每張玻片的5個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野中隨機(jī)選擇出100個(gè)細(xì)胞：陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為胞核或胞漿中染色出棕黃色顆粒；通過(guò)評(píng)分半定量分析法來(lái)判定組織陽(yáng)性程度，即將陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)計(jì)分×染色強(qiáng)度的計(jì)分=蛋白的相對(duì)表達(dá)量。其中，陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比<10%；1分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比11%～25%；2分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比26%～50%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比51%～75%；4分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比>75%。染色強(qiáng)度的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無(wú)色，1分：淡黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色。蛋白相對(duì)表達(dá)量總分：強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：9～12分；中等陽(yáng)性(++)：5～8分；弱陽(yáng)性(+)：2～4分，陰性(-):0～1分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：空白對(duì)照和比卡魯胺組均為陰性(0分)，As2O3組和As2O3+比卡魯胺組均為陽(yáng)性(9分)。見圖3。

3 討論

DNA甲基化是研究相對(duì)清楚的一種表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制，而DNA的異常甲基化可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，其主要機(jī)制可能為其激活或抑制了細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因。DNA的異常甲基化可成為監(jiān)控惡性腫瘤生長(zhǎng)的潛在生物標(biāo)志物，多種研究中已證實(shí)其與基因損失修復(fù)、調(diào)控細(xì)胞周期、激素相關(guān)反映、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等多個(gè)方面密切相關(guān)[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，DNA CpG島甲基化導(dǎo)致了啟動(dòng)子的失活及基因沉默，如COX-2、ER、MDR1、hMLH1等的甲基化[7-10]。在前列腺癌中，很多基因功能喪失的主要或者唯一的機(jī)制可能就是DNA異常甲基化[11]。GSTP1作為一種解毒酶，是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶家族中的重要成員，它在抗細(xì)胞損傷、抗腫瘤方面具有極其重要的作用。它的異常甲基化可導(dǎo)致GSTP1基因的失活，各種致瘤因素因此更容易攻擊前列腺中正常的上皮細(xì)胞，使其癌變，同時(shí)腫瘤細(xì)胞亦會(huì)受到某些因素的攻擊，導(dǎo)致進(jìn)一步惡性進(jìn)展[12]。同時(shí)研究表明，DNA甲基化這種表觀遺傳學(xué)事件具有可逆性，此特性使其成為藥物治療新的研究方向，以期通過(guò)某些藥物作用不同程度的減少甚至消除DNA異常甲基化，從而來(lái)治療惡性腫瘤。

圖3 As2O3對(duì)四組標(biāo)本蛋白質(zhì)表達(dá)的作用

A:空白對(duì)照組(×400倍),B:比卡魯胺組(×400倍),C:As2O3組(×400倍),D:As2O3+比卡魯胺組(×400倍)

As2O3抗腫瘤的作用涉及多方面，隨著研究的不斷深入，其中在DNA去甲基化方面具有良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)建立裸鼠前列腺癌移植瘤模型，分別采用RT-PCR、免疫組化法檢測(cè)四組瘤組織標(biāo)本中GSTP1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，采用MSP觀察As2O3對(duì)GSTP1基因的去甲基化作用。本研究中，空白對(duì)照和比卡魯胺兩組的GSTP1 mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)均為陰性，且對(duì)GSTP1 基因未表現(xiàn)出明顯的去甲基化作用，而As2O3和As2O3+比卡魯胺兩組的GSTP1 mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)均為陽(yáng)性，且兩組表達(dá)的mRNA陽(yáng)性條帶灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)對(duì)GSTP1基因均表現(xiàn)出明顯的去甲基化作用，且兩組去甲基化陽(yáng)性條帶灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；表明發(fā)揮去甲基化作用的藥物為As2O3，比卡魯胺組未出現(xiàn)目的條帶說(shuō)明其無(wú)DNA去甲基化作用。從而得出結(jié)論：一定劑量的As2O3具有逆轉(zhuǎn)前列腺癌移植瘤GSTP1 DNA甲基化狀態(tài)的作用，并能誘導(dǎo)GSTP1 mRAN和蛋白質(zhì)的重新表達(dá)；為前列腺癌的治療提供了新的方向和實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)僅是As2O3去甲基化作用研究的一部分，其具體作用機(jī)制和臨床應(yīng)用仍有待進(jìn)一步深入的研究。