基于Cyt b基因的PCR技術(shù)對牛鞭藥材的鑒定方法研究

徐巖 段思琪 翟英南 李明成 高麗君 孫麗媛

摘 要 目的：建立對牛鞭藥材的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定方法，從分子水平上對牛鞭藥材的真?zhèn)芜M行鑒定。方法：提取牛鞭及其偽品（驢鞭、豬鞭、羊鞭）的基因組DNA，并對其完整性、純度和濃度進行檢測。利用GenBank相關(guān)信息，以牛鞭的線粒體細胞色素b基因（Cyt b）為靶基因，應(yīng)用Primer-BLAST在線軟件設(shè)計特異性引物，并對不同物種鞭類樣品進行PCR擴增，對產(chǎn)物進行電泳分析;對獲得的牛鞭樣本PCR產(chǎn)物進行克隆和DNA測序驗證。對所建立的PCR鑒定方法進行特異性和重復(fù)性考察驗證。結(jié)果：提取所得的牛鞭及其偽品DNA的純度較高，無蛋白質(zhì)或RNA污染;1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，牛鞭樣本在200～300 bp之間均出現(xiàn)明顯的目的基因條帶，而其他偽品未見相應(yīng)條帶出現(xiàn)。DNA測序結(jié)果證實，所獲牛鞭樣本基因片段的核苷酸序列與GeneBank中牛鞭物種相似性均為100%。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示所建方法特異性、重復(fù)性均良好。結(jié)論：本研究所建基于Cyt b基因的PCR鑒定方法簡單、快速，準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性均良好，可滿足牛鞭及其偽品的分析鑒定需求。

關(guān)鍵詞 牛鞭;鑒定;Cyt b基因;PCR;DNA指紋

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for PCR identification of bullwhip， and to identify the authenticity of bullwhip at the molecular level. METHODS： DNA samples of bullwhip and its counterfeits （donkey whip， pig whip， sheep whip） were extracted and their integrity， purity and concentration were detected. Using GenBank related information， using mitochondrial cytochrome b （Cyt b） gene of bullwhip as target gene， Primer-BLAST online software was used to design specific primer. PCR amplification was performed for whips of different species， and electrophoretic analysis was conducted for the product. PCR products of bullwhip samples were cloned and confirmed by DNA sequencing. The specificity and repeatability of the established PCR method were verified. RESULTS： DNA purity of the bullwhip and its counterfeits was high， and there was no protein or RNA pollution. 1.5% agarose gel electrophoresis showed that there were obvious target gene bands of bullwhip samples at 200-300 bp， while no corresponding bands appeared in other counterfeit products. The results of DNA sequencing showed that the nucleotide sequence of the gene fragment of bullwhip was 100% similar to that of the bullwhip in GeneBank. Results of methodological validation showed that established method was specific and reproducible. CONCLUSIONS： The established PCR identification method based on Cyt b gene in the study is simple， rapid， accurate， specific and reproducible， and can meet the requirements of analysis and identification of bullwhip and its counterfeits.

KEYWORDS? ?Bullwhip; Identification; Cyt b gene; PCR; DNA fingerprint

自古以來，牛鞭因其明確的“以形補形”藥效，已成為中醫(yī)臨床上備受關(guān)注的常用藥物，《本草綱目》也曾記載牛鞭主治男性陽痿、早泄，有補腎壯陽、固本培元的功效。牛鞭富含雄激素、蛋白質(zhì)、脂肪等成分，不僅可作為廣大男性補腎壯陽的補藥，也可作為女性滋陰補陽、美容抗衰的佳品[1]。近年來，市面上以鞭類藥材為主藥的復(fù)方滋補方藥日漸增多，如至寶三鞭丸、海狗丸、三腎丸等;而以鞭類藥材為主藥的藥粥、藥膳、藥酒等也日益盛行[2]。但由于鞭類藥材貨源緊俏、種類繁多、價格昂貴且加工程序復(fù)雜，加之對此類藥材進行真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評定過程中所采用的檢驗方法可靠性不足，致使市場上各種偽劣產(chǎn)品層出不窮。

由于牛鞭成分復(fù)雜，目前暫未明確其功效成分，加之目前我國中藥現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中檢驗方法的局限性，故很難對牛鞭及其偽品作出準(zhǔn)確判斷，也無可供參考的法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對其質(zhì)量進行評價和控制。目前，對鞭類藥材的品種及真?zhèn)蔚蔫b定主要是依靠檢驗者主觀判斷其性狀、顯微鑒定其殘留毛干及肌肉組織或是化學(xué)分析其特征圖譜等鑒別方法，而利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等基因技術(shù)對鞭類藥材的系統(tǒng)鑒定研究尚不多見?；诖?，本研究擬采用PCR技術(shù)對牛鞭及驢鞭、豬鞭、羊鞭等偽品進行系統(tǒng)鑒定及分析，以期找出其特異性DNA指紋特征[3]，為該藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)的同時，也為該品種的開發(fā)利用提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

GL-20G-Ⅱ型變速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）;核酸蛋白分析儀（島津國際貿(mào)易上海有限公司）;9700型PCR擴增儀（美國ABI公司）;JY-600C型雙穩(wěn)定時電泳儀（北京市君意東方電泳設(shè)備有限公司）;UVWHITE-2020D型紫外凝膠成像自動分析儀（美國Cold Spring公司）;JD100-3B型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）;OSE-Y50型第三代變速組織研磨器（北京天根生化科技有限公司）;MX-S型可調(diào)式漩渦混合儀（美國Scilogex公司）。

1.2 試劑

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（貨號：S7315）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（貨號：R6628）、T載體連接試劑盒（貨號：S7508）、質(zhì)粒小提試劑盒（貨號：S7605）、2×Taq PCR Master Mix、 λHindⅢMarker、100bp Ladder Marker等購自北京天根生化科技有限公司;瓊脂糖粉購自西班牙Agrose公司;感受態(tài)細胞購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自吉林市華強試劑公司;實驗用水等級為三級。

1.3 牛鞭藥材及其偽品

牛鞭樣品分別來自延邊、科爾沁、吉興、長春、琿春等5個地區(qū)，批次編號為：延邊黃牛鞭1、延邊黃牛鞭2，科爾沁牛鞭1、科爾沁牛鞭2，吉興牛鞭1、吉興牛鞭2，長春牛鞭1、長春牛鞭2，琿春牛鞭1、琿春牛鞭2。偽品樣品（驢鞭、豬鞭、羊鞭）均為吉林市市區(qū)農(nóng)產(chǎn)品市場市售產(chǎn)品，批次編號為：驢鞭1、驢鞭2，豬鞭1、豬鞭2，羊鞭1、羊鞭2。每種鞭類樣品均采集了2個批次，每批次均采集3份樣本。所有樣品經(jīng)吉林市藥檢所金英蘭副主任藥師鑒別，分別為牛鞭藥材及驢鞭、豬鞭、羊鞭等偽品。

2 方法

2.1 樣品DNA提取

采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA。分別稱取新鮮或解凍后的牛鞭、驢鞭、豬鞭、羊鞭樣本約0.05 g，置于無菌的1.5 mL EP管中，加入無菌生理鹽水浸泡、沖洗，棄去血水，剪碎組織;加入無菌生理鹽水150 μL，于室溫下研磨至肉糜狀，以10 000 r/min離心1 min，棄去上清;加入GA緩沖液 400 μL，置于渦旋振蕩器上充分混勻;加入蛋白酶K溶液40 μL，于56 ℃水浴1 h;加入GB緩沖液400 μL，充分顛倒混勻后，于70 ℃水浴10 min;短暫離心，然后加入無水乙醇400 μL，充分混勻15 s后，再次短暫離心去除管蓋內(nèi)壁上的水珠。將得到的溶液和絮狀沉淀均加入CB3吸附柱，轉(zhuǎn)移至收集管中，以12 000 r/min離心30 s;棄去收集管中的廢液，再以12 000 r/min離心2 min;棄去收集管，打開CB 3吸附柱，置于濾紙上晾干數(shù)分鐘后，轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中;加入TE洗脫緩沖液100 μL溶解DNA，輕輕混勻，作為供試品DNA儲存液，于-20 ℃保存，備測。

2.2 樣品基因組DNA提取片段完整性檢測

取“2.1”項下獲得的樣品DNA儲存液5 μL（牛鞭、驢鞭、豬鞭、羊鞭每種鞭類隨機抽選一個樣品），與6×Loa- ding buffer溶液1 μL混勻后，點樣于0.8%瓊脂糖凝膠（含GelRed顯色劑），按2015年版《中國藥典》（四部）通則 0541第三法[4]進行電泳分析。采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察是否出現(xiàn)條帶，以判斷是否提取出完整的DNA片段。

2.3 樣品DNA提取片段的純度和濃度檢測

取“2.1”項下獲得的所有批次樣品的DNA儲存液各1 μL，采用核酸蛋白分析儀測定DNA的純度及濃度。以260 nm/280 nm波長下的光密度比值（OD260/280）反映DNA純度，當(dāng)OD260/280在1.8～2.1范圍內(nèi)，則表明所獲DNA無蛋白質(zhì)或RNA污染。根據(jù)濃度測定結(jié)果，采用水將DNA儲存液稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗，以避免DNA濃度過大造成條帶下沉，影響試驗準(zhǔn)確性。

2.4 引物設(shè)計與合成

在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）官方網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載牛鞭的基因序列（編號：HQ184045.1），以牛鞭的線粒體細胞色素b基因（Cyt b）為靶基因，應(yīng)用NCBI Primer-BLAST在線軟件設(shè)計特異性引物。其上游引物為：5′-CATCAAACATCTCATCTTGATG-3′;下游引物為：5′-AGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3′。將設(shè)計好的引物序列交由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

2.5 不同物種鞭類樣本DNA的PCR擴增及產(chǎn)物電泳分析

取“2.2”項下樣本DNA稀釋液為模板（牛鞭、驢鞭、豬鞭、羊鞭每種鞭類隨機抽選一個樣品），以無菌雙蒸水作為陰性對照，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（總體積為20 μL）包括：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，無菌雙蒸水8 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。所得產(chǎn)物于4 ℃保存。

取PCR產(chǎn)物5 μL，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含GelRed顯色劑），按2015年版《中國藥典》（四部）通則 0541第三法[4]進行電泳分析。采用紫外凝膠成像自動分析儀觀察PCR產(chǎn)物條帶的位置及明暗程度，并拍照記錄。

2.6 牛鞭樣本的DNA測序驗證

將“2.5”項下獲得的牛鞭樣本PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入質(zhì)粒進行克隆。具體步驟：將樣品PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶;采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化與收集;使用T載體連接試劑盒將已經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接，金屬浴過夜;利用冷熱交替使DH5α感受態(tài)細胞胞吞上述T載體連接產(chǎn)物，培養(yǎng)一定時間;經(jīng)藍白斑篩選后選擇合適菌落在液體培養(yǎng)基中擴增;使用質(zhì)粒小提試劑盒將菌液中的質(zhì)粒進行提取?？寺⊥瓿珊?，將含有目的片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)交上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結(jié)果以NCBI Nucleotide-BLAST在線軟件進行比對，進行DNA物種鑒定。

2.7 方法學(xué)驗證

2.7.1 特異性試驗 在所有鞭類樣品中，每批次隨機抽取一份DNA稀釋液為模板，以無菌雙蒸水作為陰性對照，按“2.5”項下方法進行PCR擴增及1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.7.2 重復(fù)性試驗 在同一實驗室內(nèi)，由同一實驗人員在相同條件下按“2.7.1”項下方法重復(fù)進行2次試驗。

3 結(jié)果

3.1 樣品基因組DNA提取片段完整性

0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所提取的牛鞭及其偽品樣品基因組DNA均在相應(yīng)泳道內(nèi)出現(xiàn)明顯條帶，表明已成功提取樣品基因組DNA，詳見圖1。

3.2 樣品DNA的純度和濃度

結(jié)果顯示，每批次牛鞭及其偽品提取所得DNA的OD260/280均在1.8～2.0范圍內(nèi)，表明均未被蛋白或RNA污染。其純度和濃度檢測結(jié)果詳見表1。

3.3 樣品DNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，牛鞭樣本在200～300 bp之間均出現(xiàn)明顯條帶，幾種偽品未見條帶，表明該方法能夠?qū)⑴１迾颖炯捌鋫纹愤M行區(qū)分。PCR產(chǎn)物電泳圖詳見圖2。

3.4 牛鞭樣本DNA測序結(jié)果

測序結(jié)果經(jīng)NCBI Nucleotide-BLAST軟件比對后顯示，牛鞭樣品所得目的片段的核苷酸序列與GeneBank中已登記的牛鞭物種相似性均為100%，證明克隆所得DNA片段即為牛鞭目的基因片段。以延邊黃牛鞭為例，其測序結(jié)果詳見圖3。

3.5 方法學(xué)驗證結(jié)果

3.5.1 特異性考察結(jié)果 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，僅牛鞭D(zhuǎn)NA模板擴增產(chǎn)物在200～300 bp出現(xiàn)了1條目的片段條帶，而驢鞭、豬鞭、羊鞭等偽品樣本DNA電泳結(jié)果均為陰性，未見產(chǎn)物條帶，詳見圖4。這表明本方法特異性良好，能準(zhǔn)確區(qū)分牛鞭及其偽品。

3.5.2 重復(fù)性考察結(jié)果 2次重復(fù)試驗結(jié)果均顯示，牛鞭樣本DNA模板在200～300 bp之間出現(xiàn)了1條目的片段，其余偽品（驢鞭、豬鞭、羊鞭）樣本DNA模板擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果均為陰性，詳見圖5。2次檢測結(jié)果中，樣本DNA出現(xiàn)帶的位置均一致，僅條帶明暗程度略有不同，可能與樣本濃度有關(guān)。這表明本方法重復(fù)性良好，在相同條件下，試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。

4 討論

迄今為止，我國中藥材鑒定一直采用基源鑒定、性狀鑒定[5]、顯微鑒定[6]及理化鑒定[7]等四大傳統(tǒng)鑒定方法，以上方法在生物學(xué)的鑒定標(biāo)識上都屬于物種表型鑒定。由于上述方法容易受到藥材所處自然環(huán)境、生長階段、采收加工等相關(guān)因素影響，因此存在變異性大和偽造品不易鑒定等缺點[8]。例如，傳統(tǒng)的方法是依據(jù)鑒定者的經(jīng)驗通過正偽品整體長度、色澤、橫環(huán)紋等性狀差異進行鑒別，雖然操作簡單、容易操作，但主觀性較強，其準(zhǔn)確度往往取決于鑒定者的經(jīng)驗[9];顯微鑒定法是借助殘留毛干直徑、髓干比例、平滑肌纖維直徑、橫紋肌纖維直徑等量化特征進行分辨，過程雖精密但效率較低[10];紅外光譜法能夠保持樣本的完整性，可以定性檢測樣品，顯示特征性峰，但對實驗人員技術(shù)要求高;聚丙烯酰胺凝膠電泳利用蛋白遷移率的不同，能直觀顯示出特異譜帶的數(shù)量和位置，但操作復(fù)雜、用時較久;高效液相色譜法雖然檢測靈敏度較高，但同時其分析成本和儀器的日常維護費用較高[11]。盡管現(xiàn)在已經(jīng)通過多角度、多層面鑒定方法對鞭類藥材進行分析，建立了相對較為客觀的品質(zhì)評價體系，但以上檢測方法并未從遺傳位點上區(qū)分出鞭類藥材，使得至今未能研發(fā)出穩(wěn)定性和有效性較高的用于區(qū)分牛鞭及其偽品的特異性DNA分子標(biāo)記方法。

本研究應(yīng)用具有高度種質(zhì)特異性的PCR鑒定技術(shù)，在分子水平上利用生物體內(nèi)遺傳信息載體檢測被鑒定對象的遺傳標(biāo)記特征，在進行中藥鑒定時比傳統(tǒng)中藥鑒定方法更科學(xué)、客觀和準(zhǔn)確。位于線粒體內(nèi)膜磷脂分子雙層中的Cyt b基因，長度適中，結(jié)構(gòu)簡單，進化速度適宜，是闡明物種差異、遺傳多樣性較為合適的DNA片段[12]。PCR分子鑒定技術(shù)是對各種藥材，尤其是中藥易混品種，通過基因序列分析尋找其保守且特異的指紋區(qū)段，設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，從分子水平上對中藥材進行鑒定及分析的基因技術(shù)手段[13-14]，可為藥材正本清源提供科學(xué)準(zhǔn)確的判定依據(jù)，同時也是牛鞭等中藥材鑒定的發(fā)展趨勢。

本研究將不同批次購買的牛鞭及其偽品（驢鞭、豬鞭、羊鞭）樣本進行DNA提取;同時，在GenBank中查找鞭類Cyt b基因的相關(guān)信息，根據(jù)牛鞭與其他鞭類基因序列的差異，確定牛鞭的特異片段并以該片段為基礎(chǔ)設(shè)計特異性引物，確保選擇性地擴增相應(yīng)的牛鞭D(zhuǎn)NA條帶。經(jīng)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和條件，確定退火溫度為58 ℃，擴增的目的條帶約為256 bp。PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析結(jié)果顯示，含牛鞭成分的樣本均出現(xiàn)目的基因條帶，而偽品即其他種屬鞭類樣品均未見相應(yīng)條帶，表明所設(shè)計的PCR引物特異性強，能有效區(qū)分牛鞭和其他偽品。使用DNA測序技術(shù)將牛鞭及其偽品的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入T克隆載體進行克隆測序，并在NCBI Nucleotide-BLAST軟件中比對結(jié)果，可確證牛鞭的種屬，也進一步證實了該鑒定方法的特異性較強。經(jīng)方法學(xué)考察表明，該PCR鑒定方法特異性和重復(fù)性均較好。

綜上所述，本研究根據(jù)牛鞭D(zhuǎn)NA指紋的特征，建立了基于牛鞭藥材Cyt b基因的PCR鑒定方法，該方法簡單、快速，準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性均良好，可滿足牛鞭及其偽品的分析鑒定需求，可作為鑒別鞭類制品物種起源的有效手段。

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（收稿日期：2019-07-03 修回日期：2019-10-30）

（編輯：段思怡）