鹽酸丁卡因醇質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化

張楠 張丹參 景永帥 蘇曉梅 張健美

摘 要 目的：建立鹽酸丁卡因（TCH）醇質(zhì)體的含量測定方法，并對其制備工藝進行優(yōu)化。方法：采用高效液相色譜法測定TCH的含量;采用注入-超聲法制備TCH醇質(zhì)體。以TCH對照品加入量、蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為因素，以包封率為指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法對工藝進行優(yōu)化，并對所制醇質(zhì)體進行表征以及初步穩(wěn)定性考察。結(jié)果：TCH的質(zhì)量濃度線性范圍為10～100 μg/mL（r=0.999 5）;定量限為0.045 μg/mL，檢測限為0.021 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率為97.80%～103.20%（RSD=0.36%，n=9）。最優(yōu)制備工藝為TCH對照品加入量1 mg，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度7 mg/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)33%;在此工藝條件下，平均包封率為64.50%（n=3），與預(yù)測值（64.92%）的相對誤差為0.64%。TCH醇質(zhì)體為微有藍色乳光的澄清液體，其外觀為球形，形態(tài)圓整、光滑，大小均一，平均粒徑為（80.33±2.24）nm，平均電位為（-22.6±1.33）mV。初步穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，TCH醇質(zhì)體在4 ℃避光且密封的環(huán)境中放置10 d穩(wěn)定性良好。結(jié)論：優(yōu)化所得TCH醇質(zhì)體的制備工藝穩(wěn)定、可行;所建含量測定方法操作簡便、快捷。

關(guān)鍵詞 鹽酸丁卡因;醇質(zhì)體;高效液相色譜法;注入-超聲法;星點設(shè)計-響應(yīng)面法;包封率;工藝優(yōu)化

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for determining the content of tetracaine hydrochloride （TCH） ethosomes， and to optimize the preparation technology. METHODS： The content of TCH was determined by HPLC. TCH ethosomes were prepared with injection-ultrasonic method. Using drug-loading amount， egg lecithin concentration and ethanol volume fraction as factor， encapsulation efficiency as index， central composite design-response surface methodology was used to optimize the prescription based on the single factor test. The prepared ethosomes were characterized and the stability was evaluated. RESULTS： The linear range of TCH was 10-100 μg/mL （r=0.999 5）; the limit of quantification was 0.045 μg/mL， and detection limit was 0.021 μg/mL. RSD of precision， stability and repeatability tests were less than 2%. The recoveries ranged 97.80%-103.20% （RSD=0.36%， n=9）. The optimal preparation technology included that the adding amount of TCH control was 1 mg; the concentration of egg lecithin was 7 mg/mL， and ethanol volume fraction was 33%. Under this technology， the average encapsulation efficiency was 64.50% （n=3）， the relative error of which from the predicted value （64.92%） was 0.64%. TCH ethosome was a clear blue liquid with a blue opalescence. Its appearance was spherical， its shape was round， smooth， uniform in size; the average particle size was （80.33±2.24） nm， and the average Zeta potential was （-22.6±1.33） mV. TCH ethosome was stable during 10 days under 4 ℃， sealed and protected from light. CONCLUSIONS： The optimal preparation process is stable and feasible. Established method is simple and rapid.

KEYWORDS? ?Tetracaine hydrochloride; Ethosomes; HPLC; Injection-ultrasonic method; Central composite design-response surface methodology; Encapsulation efficiency; Technology optimization

鹽酸丁卡因（TCH）是一種應(yīng)用廣泛的長效局部麻醉藥，具有脂溶性強、麻醉效能高的特點[1-3]。有研究表明，TCH比利多卡因更具有親脂性，該藥可聚集在表皮的角質(zhì)層中并慢慢擴散，能夠有效延長麻醉的持續(xù)時間[4]。但目前上市的TCH凝膠劑和貼劑均存在毒性大、起效慢（使用后30～40 min起效）的缺點[5]。透皮給藥系統(tǒng)具有能避免肝臟首過效應(yīng)、控制藥物輸送、減少給藥頻率、改善患者依從性等優(yōu)點[6]。理想的透皮用局部麻醉藥應(yīng)是能穿透皮膚表皮而產(chǎn)生有效的局部麻醉作用的藥物[7-8]。皮膚是人體最大的器官，可作為局部或全身藥物的傳遞途徑，但表皮的角質(zhì)層可阻礙親水性和高分子量藥物的滲透[9]。

醇質(zhì)體是含有較高濃度乙醇的新型脂質(zhì)囊泡載體，可將具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的藥物由皮膚表層有效傳遞到皮膚深層。有研究發(fā)現(xiàn)，乙醇能夠有效促進透皮制劑及美容劑的透皮吸收[10]。由于醇質(zhì)體粒徑較小且具有負電位和較高的包封率，因此其用于透皮給藥系統(tǒng)可大大縮短起效時間，優(yōu)于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體[11-13]?；诖耍狙芯恳訲CH為主藥，采用注入-超聲法制備了TCH醇質(zhì)體，并采用高效液相色譜法（HPLC）對其含量進行測定，旨在為TCH新劑型的研究提供思路，也為TCH用于透皮給藥系統(tǒng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括自動進樣器、在線脫氣系統(tǒng)、二極管陣列檢測器（美國Waters公司）;UV-2100型紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）;H-7650型透射電鏡（日本日立公司）;4-1S型高速離心機（美國Sigma公司）;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;BT100-2J型蠕動泵（德國Ianger公司）;ZEN3690型馬爾文粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）;KQ5200DV型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;ME235P型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

TCH對照品（美國Sigma公司，批號：T7508，純度：≥99%）;蛋黃卵磷脂（日本精化株式會社，批號：PC-98T）;膽固醇（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號：B41239）;葡聚糖G-50凝膠（北京索萊寶科技有限公司，批號：S8150）;乙腈為色譜純，無水乙醇、甲醇均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TCH醇質(zhì)體制備方法的篩選

2.1.1 注入-超聲法 精密稱取一定量的蛋黃卵磷脂、膽固醇、TCH對照品，溶于無水乙醇3 mL中，密封，即得有機相，將其置于磁力攪拌器上，保持30 ℃條件下以1 000 r/min轉(zhuǎn)速攪拌;另精密量取水7 mL，以200 μL/min的速度加入有機相中，加入完成后攪拌30 min，再超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min，即得TCH醇質(zhì)體[14]，并按公式計算包封率[包封率（%）=洗脫液中TCH的質(zhì)量/TCH總質(zhì)量×100%[15]，下同]。結(jié)果，包封率為47.32%。

2.1.2 薄膜分散法 精密稱取一定量的蛋黃卵磷脂、膽固醇、TCH對照品，置于梨形瓶中，加入氯仿-甲醇溶液（2 ∶ 1，V/V）10 mL，待完全溶解后快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至瓶壁上出現(xiàn)干脂質(zhì)薄膜，然后加入30%乙醇水溶液10 mL，再超聲處理5 min，即得TCH醇質(zhì)體[16-17]，并按公式計算包封率。結(jié)果，包封率為36.83%。

2.1.3 逆向蒸發(fā)法 精密稱取一定量的蛋黃卵磷脂、膽固醇，溶于無水乙醚10 mL中作為油相;另取TCH對照品，溶于 30%乙醇水溶液10 mL中作為水相;于室溫下將水相加入油相中，搖勻，探頭超聲，形成油包水型乳劑，快速轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，蒸發(fā)至凝膠狀;渦旋使凝膠部分塌陷，減壓蒸發(fā)殘留乙醚，得醇質(zhì)體混懸液，超聲處理5 min，即得TCH醇質(zhì)體[18]，并按公式計算包封率。結(jié)果，包封率為19.35%。

綜上可知，注入-超聲法制得的TCH醇質(zhì)體包封率最高，故選擇注入-超聲法制備TCH醇質(zhì)體。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo-BDS（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫銨溶液（40 ∶ 60，V/V）;流速：1 mL/min;檢測波長：310 nm;柱溫：25 ℃;進樣量：10 μL[19-20]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取TCH對照品1 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲處理2 min，即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 空白對照溶液的制備 分別取蛋黃卵磷脂70 mg、膽固醇2 mg，溶于無水乙醇3 mL中，按“2.1.1”項下方法制備空白醇質(zhì)體;精密量取該空白醇質(zhì)體1 mL，加甲醇破乳并定容至10 mL，超聲處理2 min，即得空白對照溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密量取“2.1.1”項下制備的TCH醇質(zhì)體1 mL，加甲醇破乳并定容至10 mL，超聲處理2 min，使其破乳完全，即得供試品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述對照品溶液、空白對照溶液、供試品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于8 000，空白對照溶液對測定無干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取TCH對照品，溶于水中，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的TCH貯備液;精密量取該貯備液適量，用甲醇分別制成質(zhì)量濃度為10、20、40、60、70、80、100 μg/mL的線性關(guān)系溶液。取各線性關(guān)系溶液按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以TCH質(zhì)量濃度（μg/mL，x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為y=50 120x-75 639（r=0.999 5）。結(jié)果表明，TCH質(zhì)量濃度在10～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 定量限與檢測限考察 取“2.2.6”項下TCH貯備液，用甲醇逐級稀釋，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結(jié)果，TCH的定量限為0.045 μg/mL，檢測限為0.021 μg/mL。

2.2.8 精密度試驗 取“2.2.6”項下質(zhì)量濃度為10、40、80 μg/mL的線性關(guān)系溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于同日內(nèi)重復(fù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，日內(nèi)精密度峰面積的RSD分別為1.81%、0.13%、1.52%（n=6）。取上述線性關(guān)系溶液避光保存，于第2、3天分別按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，日間精密度峰面積的RSD分別為1.06%、0.07%、1.19%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.4”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，峰面積的RSD為1.07%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 重復(fù)性試驗 取“2.1.1”項下制備的TCH醇質(zhì)體適量，共6份，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果，含量的RSD為1.12%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗 精密量取“2.2.3”項下空白醇質(zhì)體2 mL，共9份，分別置于10 mL量瓶中;另精密量取“2.2.6”項下TCH貯備液，用水分別制成高、中、低質(zhì)量濃度（500、300、100 μg/mL）的TCH對照品溶液，分別加入上述量瓶中，用甲醇定容，超聲處理2 min，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.1.12 樣品含量測定 取“2.1.1”項下制備的TCH醇質(zhì)體適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量，平行操作3次。結(jié)果，含量為39.62%～40.41%（n=3）。

2.3 洗脫曲線的考察

2.3.1 TCH對照品溶液的洗脫曲線 從葡聚糖G-50凝膠微柱頂端中心緩慢加入“2.2.2”項下TCH對照品溶液200 μL（防止濺到邊緣），以3 000 r/min離心3 min，收集濾液;另從葡聚糖G-50凝膠微柱頂端中心緩慢加入超純水200 μL，以3 000 r/min離心3 min，收集濾液，從葡萄糖G-50凝膠微柱頂端中心緩慢加入超純水200 μL開始至收集濾液，重復(fù)操作15次，收集每次離心后的濾液[21];將離心后的濾液用甲醇定容至10 mL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，繪制洗脫曲線，詳見圖2。由圖2可知，從第7次離心后開始，過濾液中可檢測到游離的TCH，提示葡聚糖G-50凝膠微柱對游離TCH具有一定的吸附作用。

2.3.2 TCH醇質(zhì)體的洗脫曲線 取“2.1.1”項下制備的TCH醇質(zhì)體200 μL，按“2.3.1”項下方法收集濾液，將離心后的濾液用甲醇破乳并定容至10 mL，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，繪制洗脫曲線，詳見圖3。由圖3可知，0～4管為TCH醇質(zhì)體，7～13管為游離的TCH，提示葡聚糖G-50凝膠微柱能將TCH醇質(zhì)體和游離TCH有效地分離。

2.4 包封率影響因素的考察

通過前期預(yù)試驗及查閱相關(guān)文獻[22-23]后發(fā)現(xiàn)，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度、TCH對照品加入量、乙醇體積分?jǐn)?shù)對包封率影響較大，因此本研究以上述3個因素為指標(biāo)進行單因素試驗。

2.4.1 蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度 以TCH對照品加入量為2 mg、乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、膽固醇質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、超聲時間為5 min，考察不同蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度（5、6、7、8 mg/mL）對包封率的影響，重復(fù)操作3次，詳見圖4A。由圖4A可知，當(dāng)?shù)包S卵磷脂濃度為7 mg/mL時包封率最高，故選擇蛋黃卵磷脂濃度范圍為6～8 mg/mL進行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.2 TCH對照品加入量 以蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為7 mg/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、膽固醇質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、超聲時間為5 min，考察不同TCH對照品加入量（0.5、1、1.5、2、3、4 mg）對包封率的影響，重復(fù)操作3次，詳見圖4B。由圖4B可知，TCH對照品加入量為1 mg時包封率最高，故選擇TCH對照品加入量范圍為0.5～1.5 mg進行后續(xù)優(yōu)化。

2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù) 以蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為7 mg/mL、TCH對照品加入量為1 mg、膽固醇質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、超聲時間為5 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、25%、30%、35%、40%）對包封率的影響，重復(fù)操作3次，詳見圖4C。由圖4C可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時包封率最高，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為25%～40%進行后續(xù)優(yōu)化。

2.5 TCH醇質(zhì)體的處方工藝優(yōu)化

2.5.1 試驗設(shè)計 根據(jù)“2.4”項下單因素試驗結(jié)果，以TCH對照品加入量（X1）、蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）為變量，以包封率（Y）為指標(biāo)，進行3因素5水平試驗設(shè)計，因素與水平見表2（α=1.732），試驗方案設(shè)計與結(jié)果見表3。

2.5.2 方程擬合 根據(jù)表3對方程進行線性擬合，以包封率為指標(biāo)，得二項式方程為：Y=64.88-1.45X1-0.53X2+0.84X3+1.06X1X2-3.16X1X3+3.93X2X3-21.65X12-17.8X22-20.29X32（R2=0.987 6）。該模型的P<0.000 1，具有極大顯著性，失擬項P=0.226 0>0.05，說明該模型無失擬現(xiàn)象，表明此方程具有良好的準(zhǔn)確性，可用于TCH醇質(zhì)體處方工藝的分析和預(yù)測，方差分析結(jié)果見表4。

2.5.3 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，繪制響面圖和等高線圖，詳見圖5。由圖5可知，X1與X2、X1與X3、X2與X3交互作用顯著，且包封率均隨TCH對照品加入量、蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度以及乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

2.5.4 最優(yōu)工藝的確定 采用Design-expert 8.0.6軟件得到最優(yōu)工藝為TCH對照品加入量0.98 mg，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度6.99 mg/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)32.67%;預(yù)測包封率為64.92%。為了方便試驗操作，將軟件得到的工藝處方進行優(yōu)化，即TCH對照品加入量為1 mg，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為7 mg/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為33%。

2.5.5 驗證試驗 按“2.5.4”項下最優(yōu)處方工藝制備TCH醇質(zhì)體，平行操作3次。結(jié)果顯示，3次試驗所得醇質(zhì)體包封率為64.62%、64.52%、64.37%，平均值為64.50%，與預(yù)測值（64.92%）的相對偏差為0.64%，提示該制備工藝穩(wěn)定、可行。

2.6 優(yōu)化工藝所制TCH醇質(zhì)體的表征

2.6.1 外觀評價 TCH醇質(zhì)體為微有藍色乳光的澄清液體，與文獻報道[24]一致。

2.6.2 粒徑 分別取 “2.5.4”項下制備的TCH醇質(zhì)體適量，置于10 mL量瓶中，加水稀釋50倍，用馬爾文粒度儀分別測定粒徑和電位。結(jié)果，平均粒徑為（80.33±2.24）nm，多分散系數(shù)為0.145±0.03，粒子呈正態(tài)分布且分散性良好，平均表面電位為（-22.6±1.33）mV，詳見圖6。

2.6.3 形態(tài) 透射電鏡下可見，TCH醇質(zhì)體外觀為球形，形態(tài)圓整、光滑、大小均一、分散均勻，詳見圖7。

2.7 優(yōu)化工藝所制TCH醇質(zhì)體的初步穩(wěn)定性試驗

按“2.5.4”項下最優(yōu)處方工藝制備TCH醇質(zhì)體，取適量于4 ℃冰箱中密封避光保存，分別于第0、5、10天觀察其性狀并測定其包封率，重復(fù)操作3次，詳見表5。由表5可知，TCH醇質(zhì)體的性狀、包封率均未發(fā)生明顯變化，提示TCH醇質(zhì)體在4 ℃避光且密封的環(huán)境中放置10 d穩(wěn)定性良好。

3 討論

本研究采用HPLC法測定了TCH醇質(zhì)體中TCH的含量，該方法的專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均符合要求，且操作簡單、快捷。

常用的制備醇質(zhì)體方法有注入-超聲法、薄膜分散法和逆向蒸發(fā)法[25]。本研究以包封率為指標(biāo)，對TCH醇質(zhì)體的制備方法進行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法存在有機溶劑殘留，不適于工業(yè)化生產(chǎn);而采用注入-超聲法制得TCH醇質(zhì)體的包封率最高，且操作簡單、方便、可重復(fù)。

有研究認為，影響TCH醇質(zhì)體包封率的因素很多，如蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度、TCH對照品加入量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、攪拌時間、攪拌溫度等[22]。本研究在前期預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，超聲時間過長，TCH醇質(zhì)體膜會發(fā)生破裂，造成TCH泄露;超聲時間過短，又可造成TCH醇質(zhì)體粒徑過大、分布不均勻，因此確定超聲時間為5 min。有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇的加入可以增加醇質(zhì)體磷脂雙分子層的韌性，提高醇質(zhì)體的穩(wěn)定性[26] 。本研究發(fā)現(xiàn)，處方中加入一定量的膽固醇可提高TCH醇質(zhì)體的包封率，但濃度過高會造成包封率減小，這可能是因為高濃度的膽固醇可造成脂質(zhì)體膜的不對稱性增加，從而引起膜破裂、藥物滲透率增加[26]，因此選擇膽固醇質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。

綜上所述，本研究得到最優(yōu)工藝處方為TCH對照品加入量為1 mg，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為7 mg/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為33%;平均包封率為64.50%。優(yōu)化所得TCH醇質(zhì)體的制備工藝穩(wěn)定、可行，所建含量測定方法操作簡單、快捷。

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（收稿日期：2019-07-02 修回日期：2019-11-07）

（編輯：陳 宏）