金水六君煎及其拆方含藥血清對A549細胞中黏蛋白MUC5AC及水通道蛋白AQP5表達的影響

柏正平 劉雨 譚小寧 譚電波 鄧秀娟 李仲普 劉俊 譚光波

〔摘要〕 目的 觀察金水六君煎及其拆方含藥血清對肺腺癌細胞A549黏液高分泌模型黏蛋白5AC（MUC5AC）及水通道蛋白5（AQP5）表達的影響，探討金水六君煎治療氣道黏液高分泌的作用機制。方法 將A549細胞分為空白組、模型組、金水六君煎組、養(yǎng)陰組、化痰組。采用人中性粒彈性蛋白酶（HNE）25 nmmol/L誘導A549細胞黏液高分泌，20%金水六君煎及其拆方含藥血清干預24 h。RT-PCR、Western blot法檢測細胞MUC5AC、AQP5基因與蛋白表達。ELISA法檢測細胞上清液MUC5AC、AQP5蛋白表達。結(jié)果 與空白組比較，模型組細胞MUC5AC mRNA與蛋白表達明顯增多（P<0.05），AQP5 mRNA與蛋白表達明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組細胞MUC5AC mRNA表達明顯降低（P<0.05），AQP5 mRNA表達明顯增多（P<0.05）;化痰組A549細胞MUC5AC蛋白表達顯著降低（P<0.01），AQP5蛋白表達明顯升高（P<0.05）。模型組細胞上清液MUC5AC、AQP5蛋白表達較空白組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 金水六君煎可明顯抑制A549細胞MUC5AC產(chǎn)生，促進AQP5表達，糾正黏蛋白/水鹽比例失衡可能是其治療氣道黏液高分泌的可能機制。

〔關鍵詞〕 金水六君煎;A549細胞;黏液高分泌;黏蛋白;水通道蛋白

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.008

Effects of Serum Containing Jinshui Liujun Decoction and Its Components on the Expression of Mucin MUC5AC and Aquaporin AQP5 in A549 Cell Mucus Hypersecretion Model

BAI Zhengping1， LIU Yu1， TAN Xiaoning2， TAN Dianbo2， DENG Xiujuan2， LI Zhongpu2， LIU Jun2， TAN Guangbo2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕? Objective To investigate the effects of Jinshui Liujun Decoction and its components on the expression of mucin 5AC （MUC5AC） and aquaporin 5 （AQP5） in the mucus hypersecretion model of human lung adenocarcinoma A549 cells， and to explore the mechanism of action of Jinshui Liujun Decoction in the treatment of airway mucus hypersecretion. Methods A549 cells were divided into blank group， model group， Jinshui Liujun Decoction group， Yin-nourishing group， and phlegm-resolving group. Mucus hypersecretion in A549 cells was induced using human neutral elastase （HNE） at a concentration of 25 nmmol/L， followed by intervention with 20% serum containing Jinshui Liujun Decoction and its components for 24 h. RT-PCR and Western blot were used to determine the mRNA and protein expression levels of MUC5AC and AQP5. Meanwhile， enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the expression of MUC5AC and AQP5 in cell supernatant. Results Compared with the blank group， the model group had significantly increased expression of MUC5AC mRNA and protein （P<0.05） and significantly reduced? expression of AQP5 mRNA and protein （P<0.05）. Compared with the model group， the Jinshui Liujun Decoction group and the Yin-nourishing group had significantly reduced expression of MUC5AC mRNA （P<0.05） and significantly increased expression of AQP5 mRNA （P<0.05）. The phlegm-revolving group showed a significant reduction in the expression of MUC5AC protein （P<0.01） and a significant increase in the expression of AQP5 protein （P<0.05）. There was no significant difference in the protein expression of MUC5AC and AQP5 in cell supernatant between the model group and the blank group （P>0.05）. Conclusion Jinshui Liujun Decoction can significantly inhibit the expression of MUC5AC and promote the expression of AQP5 in A549 cells. Its ability to correct the imbalance of mucin/water-salt ratio may be a possible mechanism for the treatment of airway mucus hypersecretion.

〔Keywords〕 Jinshui Liujun Decoction; A549 cell; mucus hypersecretion; mucin; aquaporin

慢性阻塞性肺?。╟hronic obstruetive pulmonary

diseases， COPD） 是呼吸系統(tǒng)的一種慢性疾病，氣道黏液高分泌是其重要病理生理特征，黏液高分泌可導致氣道阻塞、氣流受限、通風灌注錯配及氣體交換減值與細菌定植，從而加速FEV1下降過程[1]。氣道黏液高分泌除黏蛋白的絕對量增多外，還與黏蛋白/水鹽比例失衡有關，其中黏蛋白5（MUC5AC）決定黏液的黏度，水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)的水的轉(zhuǎn)運和黏蛋白/水鹽比例。COPD黏液高分泌機制中MUC5AC表達明顯升高，AQP5表達顯著降低[2]。金水六君煎出自《景岳全書》，臨床主要應用于治療陰虛痰飲證，臨床研究能明顯改善肺腎陰虛型慢性支氣管炎及COPD患者咳喘痰多，藥效學研究能明顯增加氣管液體分泌量，促進痰液排出[3-6]，但其治療氣道黏液高分泌機制研究未見報導。本文將金水六君煎拆方成養(yǎng)陰組分及化痰組分進行研究，采用人中性粒彈性蛋白酶誘導肺腺癌細胞A549建立氣道黏液高分泌細胞模型，通過觀察金水六君煎及其拆方對黏蛋白MUC5AC、水通道蛋白AQP5表達的影響，探討金水六君煎治療氣道黏液高分泌的可能機制，為金水六君煎臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗動物? 雄性SD大鼠40只，鼠齡10～12周，體質(zhì)量（220±20）g，由湖南省斯萊克實驗動物中心提供，許可證號[SYXK（湘）2016-0002]，合格證號：N0.43004700042712。飼養(yǎng)于溫度22～26 ℃、相對濕度50%～70%環(huán)境，通風換氣8～12次/h，自由攝食飲水。

1.1.2? 細胞株? 肺腺癌A549細胞系（A549），購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，批號：1606-1。

1.1.3? 實驗藥物? 金水六君煎方藥組成根據(jù)《景岳全書》原方組成及劑量：熟地黃15 g，當歸6 g，半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g。加入生姜10 g。養(yǎng)陰組：熟地黃15 g，當歸6 g?；到M：半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g。中藥飲片購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。

1.1.4? 主要試劑? 人中性粒彈性蛋白酶（英國abcam公司，貨號：ab91099）;DMEM（美國HyClone公司）;胎牛血清（美國Gibco公司）;0.25%胰酶消化液（美國Gibco公司）;1%青霉素和鏈霉素（上?；鄯f生物技術(shù)有限公司）;MUC5AC、AQP5 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：Y15037320、Y10037321）;小鼠MUC5AC單克隆抗體（美國SantaCruz公司，貨號：45M1）;AQP5兔多克隆抗體（英國abcam公司，貨號：ab78486）;HRP goat anti-mouse/ Rabbit IgG（美國Proteintech公司），RIPA裂解液/蛋白酶抑制劑，SuperECL Plus 超敏發(fā)光液（美國Thermo公司）;5X蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;β-actin、MUC5AC、AQP5引物（上海生工生物工程股份有限公司）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture（北京康為世紀生物技術(shù)有限公司）;SYBRGREEN I核酸染料（北京普博欣生物科技責任有限公司）。

1.1.5? 主要儀器? 細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，HERAcell 2401）;倒置顯微鏡（北京同舟同德儀器儀表有限公司，DSZ2000）; 全自動酶標儀（意大利Diasorin公司，MAX3000）;臺式冷凍離心機（力新儀器上海有限公司，Neofuge23R）;電泳儀（美國Biorad，164-5050）;轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠，DYCZ-40A）;全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司，GBOX-H12-E-M）;熒光PCR板（美國Thermo公司，SPL0960）;熒光定量RCP儀（美國Thermo公司，PIKO REAL96）。HERAcell2401

1.2? 方法

1.2.1? 含藥血清制備? 按照隨即數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠平均分為空白組、金水六君煎組、養(yǎng)陰組、化痰組，每組10只。大鼠給藥劑量參考按中藥血清藥理學研究通法[7]（給藥劑量=臨床常用量×動物有效劑量系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)的稀釋度）。參考人和動物體表面積折算的等效劑量比率表，大鼠的等效劑量相當于人的6.3倍，每只動物每千克體質(zhì)量給藥量按臨床人（70 kg）的等效量，培養(yǎng)基內(nèi)血清的稀釋度為5倍。換算出生金水六君煎組、養(yǎng)陰組、化痰組生藥含量分別為：22.72 g/kg、9.45 g/kg、8.77 g/kg。中藥煎煮按生藥量加入10倍水，煎煮1 h保存藥液，藥渣再加入8倍量水，煎煮1 h，合并過濾去沉淀濃縮成所需濃度：2.27 g/mL、0.96 g/mL、0.88 g/mL。參考目前常用“通法”[8]，按照10 mg/kg灌胃量每天給藥2次，連續(xù)3 d，空白對照組灌胃等體積生理鹽水。末次給藥1 h后無菌條件下腹主動脈采血，3 000 r/min離心5 min，取血清，同組血清相混合，置于56 ℃水浴滅活補體30 min，過濾器（0.22 μm孔徑）過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 細胞培養(yǎng)? 將A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/m青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，按1∶3比例傳代。

1.2.3? 細胞分組及干預? 取對數(shù)期細胞進行實驗，分為正常對照組、模型組、金水六君煎組、養(yǎng)陰組和化痰組，每組設3個復孔。黏液高分泌細胞模型制備參考蘭箭[9]人中性粒細胞彈性蛋白酶（human

neutrophi lelastase， HNE）誘導法。根據(jù)預實驗結(jié)果采用終濃度為25 nmmol/L HNE，20%含藥血清干預細胞。每孔以1×105/mL密度接種于6孔板，加入DMEM培養(yǎng)基+10%FBS，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。去原培養(yǎng)基，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱饑餓培養(yǎng)24 h。去培養(yǎng)基，以孔為單位，分為空白組（加入20%空白組大鼠血清）、模型組（加入20%空白組大鼠血清和終濃度為25 nmmol/L HNE）、金水六君煎組（加入20%金水六君煎含藥血清和終濃度為25 nmmol/L HNE）、養(yǎng)陰組（加入20%養(yǎng)陰組含藥血清和終濃度為25 nmmol/L HNE）、化痰組（加入20%化痰組含藥血清和終濃度為25 nmmol/L HNE），37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后收集細胞及培養(yǎng)液上清進行檢測。

1.2.4? RT-PCR法檢測A549細胞MUC5AC、AQP5基因表達? 吸掉各組A549細胞上層培養(yǎng)液，向A549細胞中加入1 mL Trizol室溫裂解5 min后充分吹打，采用酚/氯仿萃取法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計測定RNA濃度以及260、280 nm處吸光度值，計算其純度。按HiFiScript cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA，然后以cDNA為模板按UltraSYBR Mixture合成試劑盒說明書進行擴增。反應體系：2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 ？滋L，Primer F（10 ？滋mol/L）1 ？滋L，Primer R（10 ？滋mol/L）1 ？滋L，ddH2O 11 ？滋L，cDNA 2 ？滋L，總體積共30 ？滋L。擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火50 s，共40個循環(huán)。根據(jù)所得Ct值，以β-actin為內(nèi)參、空白組樣本為對照樣品計算2-ΔΔCt，得到目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

1.2.5? Western blot法檢測A549細胞MUC5AC、AQP5蛋白表達? 用預冷PBS洗滌各組A549細胞，吸掉上清，加入160 ？滋L RIPA裂解液冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15min提取總蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒操作說明測定蛋白濃度。分別配制分離膠濃度為8%（分離MUC5AC）和10%（分離AQP5及β-actin）SDS-聚丙烯酞胺凝膠。在加樣孔按順序加入蛋白樣本20 ？滋L及蛋白Marker 3 ？滋L，按濃縮膠恒壓80 V，分離膠120 V進行電泳，待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒流300 mA MUC5AC約2 h，AQP5及β-actin約1 h。5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，加入1×TBST稀釋的小鼠MUC5AC單克隆抗體（1∶200）、AQP5兔多克隆抗體（0.1 ug/mL）和β-actin（1∶5 000），4 ℃冰箱孵育過夜。孵育結(jié)束后1×TBST洗3次×10 min，加入辣根過氧化物酶標記鼠二抗和兔二抗（1∶5 000），室溫下孵育1.5 h，1×TBST洗滌3次后置于ECL發(fā)光液中顯影，暗室曝光沖印，采用BioRad成像系統(tǒng)分析電泳條帶，QuantityOne圖像分析軟件計算基因與β-actin比值。

1.2.6? ELISA法檢測A549細胞上清液MUC5AC、AQP5蛋白表達? 吸取各組A549細胞培養(yǎng)液1 mL置于1.5 mL EP管，4 ℃、12 000 r/min離心5 min沉淀懸浮細胞，取上清液500 ？滋L進行實驗。嚴格按照試劑盒說明書進行標準品、酶結(jié)合物、顯色劑制備和樣品稀釋，在反應終止后10 min內(nèi)用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值），通過標準曲線計算各樣品濃度。

1.3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以“x±s”表示。資料符合正態(tài)性及方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析（analysis of variance， ANOVA）;不滿足正態(tài)性或方差齊性時，采用非參數(shù)檢驗秩和檢驗。結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組A549細胞MUC5AC mRNA、AQP5 mRNA表達

與空白組比較，模型組A549細胞MUC5AC mRNA表達明顯升高（P<0.05），AQP5 mRNA表達明顯減少（P<0.05）。與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組MUC5AC mRNA表達明顯降低（P<0.05），AQP5 mRNA表達明顯增加（P<0.05），化痰組MUC5AC mRNA、AQP5 mRNA表達較模型組無明顯差異（P>0.05），結(jié)果見表2。MUC5AC與AQP5擴增曲線和溶解曲線如圖1。

2.2? 各組A549細胞MUC5AC、AQP5蛋白表達

與空白組比較，模型組A549細胞MUC5AC蛋白表達顯著升高（P<0.01），AQP5蛋白表達明顯減少（P<0.05）。與模型組比較，金水六君煎組及化痰組MUC5AC蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01），化痰組AQP5蛋白表達明顯增加（P<0.05），金水六君煎組及養(yǎng)陰組AQP5蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3，圖2。

2.3? 各組A549細胞培養(yǎng)液MUC5AC、AQP5蛋白表達

與空白組比較，各組培養(yǎng)液中MUC5AC、AQP5蛋白表達無明顯差異（P>0.05）。與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組培養(yǎng)液AQP5蛋白表達增加（P<0.05）。見表4。

3 討論

氣道黏液高分泌是COPD重要的病理特征，與COPD患者的肺功能加速下降、急性加重及高住院治療率密切相關，祛痰治療應面向所有的COPD患者[10]。MUC5AC是成人呼吸道最主要的黏蛋白，氣道黏液高分泌過程MUC5AC表達明顯升高。AQP5主要表達于肺內(nèi)且對肺泡內(nèi)的水的轉(zhuǎn)運和黏膜下腺泡的黏液分泌起著重要的作用。COPD氣道黏液高分泌中黏蛋白MUC5AC表達明顯增高，AQP5表達降低。體內(nèi)及體外實驗研究證實抑制AQP5表達，可導致MUC5AC表達明顯增多[11-12]。

金水六君煎出自《景岳全書》，其主治肺腎虛寒，水泛為痰，或年邁陰虛、氣血不足外受風寒，咳嗽嘔惡多痰，喘急等證。其組方由二陳湯（半夏，陳皮，茯苓，甘草）及貞元飲（熟地黃，當歸，炙甘草）組合而成，方中當歸、熟地黃滋肺腎陰血以治本，二陳湯燥濕化痰以治標，全方標本兼治[13]。

目前用于黏液高分泌的細胞模型主要有人黏液上皮細胞癌細胞株NCI-H292、人肺腺癌細胞株A549、人原代支氣管上皮細胞NHBE。A549因具有黏液合成分泌的特性、穩(wěn)定性高、易于培養(yǎng)和傳代等優(yōu)點，已廣泛用于氣道黏液高分泌體外研究[14-15]。人中性粒彈性蛋白酶（HNE）主要由中性粒細胞釋放，是一種高效的黏液促分泌劑，能更好模擬體內(nèi)環(huán)境。本研究采用人中性粒彈性蛋白酶誘導A549細胞24 h建立體外黏液高分泌細胞模型，模型組細胞MUC5AC基因與蛋白表達較空白組均顯著升高，AQP5基因與蛋白表達較空白組均顯著降低，與體內(nèi)氣道黏液高分泌病理模型相一致[16]。與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組主要在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)A549細胞MUC5AC mRNA表達，上調(diào)AQP5 mRNA表達。化痰組主要在翻譯水平下調(diào)細胞MUC5AC蛋白表達，上調(diào)AQP5蛋白表達，提示金水六君煎不同成分之間具有不同的作用靶點。王志旺等[17-18]建立陰虛哮喘小鼠模型研究當歸平喘作用，發(fā)現(xiàn)當歸能促進小鼠肺組織AQP5表達，抑制MUC5AC的表達，通過調(diào)節(jié)肺組織水液代謝發(fā)揮平喘作用。鄧青南、周建龍等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)高濃度半夏提取物能通過抑制MUC5AC表達，上調(diào)AQP5表達抑制大鼠氣道黏液高分泌狀態(tài)。當歸養(yǎng)陰潤燥、半夏燥濕化痰可能是金水六君煎治療氣道黏液高分泌主要藥效成分。

研究結(jié)果顯示模型組細胞培養(yǎng)液中MUC5AC及AQP5蛋白表達較空白組無明顯差異，提示黏蛋白、水通道蛋白合成及分泌過程并非成一致性改變。有研究認為人中性粒彈性蛋白酶誘導黏蛋白分泌至細胞外需激活蛋白酶激活受體2（PAR2）及蛋白激酶C（PKC）[21]。與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組培養(yǎng)液中AQP5明顯增加，提示養(yǎng)陰成分可促進AQP5分泌至胞外，可解釋金水六君煎組及養(yǎng)陰組細胞AQP5基因與蛋白水平表達不一致的原因，但具體機制還需要進一步研究。

綜上，金水六君煎及其拆方含藥血清可通過上調(diào)AQP5和抑制MUC5AC表達，改善HNE誘導的細胞黏液高分泌狀態(tài)，為臨床金水六君煎治療COPD黏液高分泌提供臨床指導。但金水六君煎及其拆方調(diào)控黏蛋白MUC5AC、水通道蛋白AQP5基因與蛋白表達的信號通路及MUC5AC與AQP5相互作用機制還需要進一步深入研究。

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