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    枸骨IcFPS1基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

    2019-09-10 17:24:50馬良瓊曾慧羅彩霞張威威許鋒程水源
    廣西植物 2019年3期
    關(guān)鍵詞:表達(dá)克隆

    馬良瓊 曾慧 羅彩霞 張威威 許鋒 程水源

    摘要:法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase,F(xiàn)PS)是三萜皂苷生物合途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶,為研究FPS基因在枸骨中的功能,該研究采用PCR技術(shù)將一個(gè)FPS基因的cDNA序列從枸骨葉中分離出來(lái),并命名為IcFPS1。結(jié)果表明:根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增獲得的IcFPS1基因cDNA長(zhǎng)度為1591bp,包含一個(gè)完整的開放閱讀框,大小為1029bp。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)枸骨IcFPS1基因編碼342個(gè)氨基酸,分子量和等電點(diǎn)分別為39.58kDa和5.18。通過(guò)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白不含信號(hào)肽,不含有跨膜區(qū)域,該IcFPS1蛋白為親水性蛋白質(zhì)。通過(guò)序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白質(zhì)與其他植物的FPS蛋白質(zhì)高度同源,有共同的保守區(qū)域和氨基酸序列,其中與西洋參FPS序列的相似性高達(dá)89%。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)枸骨FPS蛋白與同屬于被子植物的五加科植物FPS蛋白親緣關(guān)系較近,說(shuō)明FPS基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)比較保守。根據(jù)蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1相互作用,參與類異戊二烯的合成代謝過(guò)程。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)IcFPS1基因在枸骨各個(gè)組織部位中均有表達(dá),其中在枸骨根中表達(dá)量最高,在莖和雌花中表達(dá)量最低。

    關(guān)鍵詞:枸骨,法尼基焦磷酸合酶,三萜皂苷,克隆,表達(dá)

    中圖分類號(hào):Q943

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1000-3142(2019)03-0328-08

    枸骨(Ilexcornuta)為冬青科灌木或喬木,四季常青,可用于綠化。同時(shí),枸骨在傳統(tǒng)上也是常用中藥之一,枸骨根、葉、果實(shí)等組織均可入藥,在常見(jiàn)病痛治療方面有較好療效(彭國(guó)全等,2011)。根據(jù)《本草拾遺》記載,枸骨葉具備清熱養(yǎng)陰、補(bǔ)肝益腎、祛風(fēng)濕等功效,在肺癆咳嗽、勞傷失血等疾病治療方面也有很好的應(yīng)用(左文健等,2011)。枸骨葉中含有許多次生代謝物質(zhì),包括三萜及其皂苷、黃酮及其多酚類化合物(李國(guó)文等,2011)。因此枸骨具有重要的商業(yè)和藥用價(jià)值。

    枸骨葉中主要成分之一的三萜皂苷是廣泛分布于人參、靈芝、三七、墨旱蓮等藥用植物中的一類重要次生代謝產(chǎn)物,屬于中藥植物的主要活性成分之一,具有抗癌、抗氧化、消炎解毒等功效(張召寶等,2015)。整個(gè)三萜生物合成過(guò)程涉及法尼基焦磷酸合酶、鯊烯合酶、鯊烯環(huán)氧酶或單加氧化酶、氧化鯊烯環(huán)化酶等一系列酶的催化。法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase,F(xiàn)PS)是一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶,它催化五碳原子的二甲丙烯基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸以頭尾連續(xù)縮合反應(yīng),進(jìn)而形成碳原子的法尼基焦磷酸,成為植物體內(nèi)皂苷、倍半萜、甾體、橡膠等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體(Cunilleraetal.,1996)。至今,在洋甘菊(楊秀梅,2013)、擬南芥(Cunilleraetal.,1996)、刺五加(周秘等,2013)、絞股藍(lán)(蔣東等,2014)、三七(陳莉等,2006)等許多植物中已經(jīng)進(jìn)行了FPS基因的分離和功能研究,研究結(jié)果證實(shí)FPS是植物三萜皂苷生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶,能夠調(diào)控植物類異戊二烯途徑,促進(jìn)三萜皂苷的合成。截至目前,在枸骨上尚且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)FPS基因的研究報(bào)道,克隆FPS基因并進(jìn)行功能研究是揭示FPS基因在枸骨三萜生物合成途徑中功能的前提。在本項(xiàng)目中,我們對(duì)枸骨FPS基因進(jìn)行了克隆、對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、并進(jìn)行了組織表達(dá)分析。研究結(jié)果可為弄清FPS基因在枸骨三萜類生物合成中的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料

    本研究中的枸骨材料采摘于長(zhǎng)江大學(xué)校園,收集五種不同的組織(根、莖、葉、雄花、雌花)用于RNA提取和基因表達(dá)分析,采摘的材料立即在液態(tài)氮中速凍并儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱中待用。

    1.2方法

    1.2.1RNA的提取和cDNA合成將枸骨的不同器官(根、莖、葉、雄花、雌花)在液氮中磨成細(xì)粉末狀,參照PlantRNAExtractionKit(TaKaRa,MiniBEST)試劑盒說(shuō)明書提取各組織總的RNA。分光光度計(jì)和瓊脂凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量較好的RNA用于cDNA的合成。枸骨cDNA的合成以RNA為模板,采用PrimeScriptTM的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,Dalian,China)完成。

    1.2.2枸骨IcFPS1基因的克隆根據(jù)枸骨的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)并合成FPS基因擴(kuò)增特異引物,上游引物為IcFPSF1:5′-ATTAAGACCATCTGTGGAGCCTAGC-3′,下游引物為IcFPSR1:5′-GGGTGACAGGTTTGTATAGCATCCA-3′。PCR反應(yīng)體系25μL,包括ddH2O16.5μL,10×Buffer2.5μL,MgCl22.0μL,dNTP0.5μL,上下游引物各1μL,cDNA模板1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,58℃退火40s,72℃延伸90s,共32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min,4℃結(jié)束。PCR擴(kuò)增結(jié)果用1%的凝膠電泳檢測(cè),利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物,純化產(chǎn)物連接到從寶生物購(gòu)買的pMD19-T載體上,并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)活化蘇醒后被均勻地涂抹于含有Amp的LB的培養(yǎng)皿中,挑取菌落進(jìn)菌液活化,并進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,陽(yáng)性結(jié)果菌液送往上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.2.3生物信息學(xué)分析IcFPS基因cDNA序列和蛋白質(zhì)序列比對(duì)利用在線工具NCBI-blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/)完成。運(yùn)用VectorNTISuitev11.5和DNAMAN8來(lái)分析IcFPS1基因的cDNA序列,進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。IcFPS1蛋白質(zhì)理化學(xué)性質(zhì)的分析采用工具ProtParamtool(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行。信號(hào)肽預(yù)測(cè)、疏水性分析、跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)分別用在線工具SignalP4.1Server、ProtScale和TMHMMServerv.2.0完成。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析借助SOPMA工具實(shí)現(xiàn)。利用軟件AlignX(VectorNTISuiteV11.5)對(duì)多種植物的FPS蛋白進(jìn)行多重比對(duì)分析,利用ClustalX2.0和MEGA6.0軟件采用鄰接(NJ)方法構(gòu)建FPS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹,使用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹可信性進(jìn)行檢驗(yàn),重復(fù)1000次。應(yīng)用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建候選蛋白與相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò),分析預(yù)測(cè)IcFPS1蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中的作用關(guān)系,保留可信度大于0.700相互作用關(guān)系,用Cytoscape3.61調(diào)整展示互作網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析使用RNA提取試劑盒(PlantRNAExtractionKit)從五種不同的組織器官樣品中提取總RNA。根據(jù)IcFPS1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物,上游引物為IcFPSRT-S:5′-ACAGATTACCGAAGGTTGGTATG-3′,下游引物為IcFPSRT-A:5′-GGTTGTCTGGAATTCTACCTCATTA-3′。qRT-PCR內(nèi)參基因選用的是IcGAPDH,上游引物序列IcGAPDH-S:5′-TATCAACGGCTTCGGTCGCA-3′,下游引物序列IcGAPDH-A:5′-GGACGGAGTCGTACTTGAGCAT-3′。引物送往上海生工生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在杭州博日科技有限公司的Linegene9600PCR儀上進(jìn)行,反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR的操作依照試劑盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser和SYBRRPremixExTaqTMII的操作步驟說(shuō)明書逐步進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?5℃、30s,95℃、5s;60℃、30s,共40個(gè)循環(huán)。每種樣品三次取樣重復(fù),三次技術(shù)重復(fù),并分別設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照(模板為ddH2O)。IcFPS1基因的相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算通過(guò)使用2-ΔΔCt法完成(Livak&Schmittgen,2001)。

    2結(jié)果與分析

    2.1IcFPS1基因cDNA克隆與序列分析

    利用特異性引物,以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,通過(guò)PCR技術(shù)從枸骨中克隆得到一條FPS基因序列,通過(guò)NCBI網(wǎng)站的在線程序Blast比對(duì)分析顯示該cDNA序列與其他物種的FPS基因序列具有較高的相一致性,克隆獲得的cDNA序列為枸骨的FPS基因,命名為IcFPS1。此cDNA序列長(zhǎng)度為1591bp,包含1029bp的開放閱讀框,編碼342個(gè)氨基酸(圖1)。

    2.2枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

    IcFPS1蛋白質(zhì)含有342個(gè)氨基酸。在線網(wǎng)站分析表明,IcFPS1蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)分別為39.58kDa和5.18。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為33.87,該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。SignalP4.1Server信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白不含有信號(hào)肽,蛋白質(zhì)疏水性分析顯示IcFPS1為親水蛋白。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域分析結(jié)果表明,IcFPS1蛋白不含有跨膜區(qū)域。通過(guò)SOPMA工具分析該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),分析結(jié)果表明IcFPS1蛋白主要由α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成,其所占比例分別為65.5%、24.56%、6.73%和3.22%。同源比對(duì)分析通過(guò)在線工具BlASTP(NCBI)和AlignX(VetctorNTI11.5)完成。用NCBI的ConservedDomainSearch工具分析蛋白質(zhì)保守域,結(jié)果顯示IcFPS1蛋白質(zhì)屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級(jí)家族的成員,含有Polyprenylsynthetase保守區(qū)域(圖2下劃線區(qū)域),表明IcFPS1參與類異戊二烯的生物合成。

    2.3枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)的同源比對(duì)

    同源比對(duì)發(fā)現(xiàn),該蛋白質(zhì)與其他植物的FPS蛋白質(zhì)相似性較高(圖2)。其中枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)和西洋參(ADJ68004)、人參(AAY87903)、常春藤(APV45530)、龍牙楤木(ADK12004)、積雪草(AAV58896)、白樺(AKQ62666)、野茶樹(ANA11766)、刺五加(AEY77151)和纈草(AIU63880)的FPS蛋白質(zhì)之間的相似性比分別為89%、88%、87%、87%、87%、87%、87%、87%和86%。不同物種之間FPS蛋白有較高的一致性,暗示在功能上可能也是相同或相似的。

    2.4IcFPS1蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析

    系統(tǒng)進(jìn)化樹采用ClustaIX2.0和MEGA6.0軟件構(gòu)建的,目的是進(jìn)一步探索FPS蛋白質(zhì)在不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系。如圖3所示,所有的FPS蛋白都來(lái)自于一個(gè)共同的祖先,不同物種的FPS蛋白質(zhì)也被清晰地歸類到三個(gè)分支,分別為植物、動(dòng)物和真菌(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示枸骨FPS1蛋白與被子植物界雙子葉植物五加科的FPS蛋白親緣關(guān)系最近,聚類在同一分支上;而薔薇科的玫瑰、梅、白梨的FPS蛋白聚類到另一分支上。該結(jié)果表明,F(xiàn)PS1蛋白可能與五加科的FPS蛋白質(zhì)在功能上更為接近。枸骨IcFPS1在功能上也可能與五加科植物的FPS蛋白相同,參與調(diào)控三萜皂苷的合成代謝。

    2.5枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

    利用STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)枸骨IcFPS1蛋白進(jìn)行相互作用分析,物種參數(shù)選擇模式植物擬南芥,構(gòu)建了的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖4)。IcFPS1蛋白可以與10個(gè)蛋白互作,其中IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1都是植物類異戊二烯合成途徑的調(diào)節(jié)酶,該互作網(wǎng)絡(luò)表明枸骨IcFPS1蛋白可能與這些蛋白存在一些相似的功能,或共同參與植物類異戊二烯的合成代謝過(guò)程。

    2.6IcFPS1的組織表達(dá)分析

    為了研究IcFPS1基因的各個(gè)組織器官的表達(dá)水平,提取枸骨的根、莖、葉、雄花、雌花的總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA,利用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定枸骨各組織器官中IcFPS1基因的表達(dá)水平。qRT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),IcFPS1基因在各個(gè)組織器官中都有表達(dá)。其中在枸骨根中的基因表達(dá)量最高,葉中表達(dá)量次之,雄花中較低,在莖和雌花中的表達(dá)量最低(圖5)。枸骨的主要藥用部位是根和葉片,本研究中IcFPS基因也在這兩個(gè)部位中表達(dá)量較高。因此,推測(cè)IcFPS基因可能參與了枸骨三萜類物質(zhì)的生物合成調(diào)控,是枸骨三萜皂苷合成代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶基因。

    3討論與結(jié)論

    FPS參與類異戊二烯生物合成途徑,屬于植物次生代謝三萜皂苷與甾醇合成途徑中的一個(gè)限速酶,也是三萜皂苷合成生物學(xué)研究的其中一個(gè)重要酶。本研究克隆得到枸骨的IcFPS1基因,對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)。結(jié)果表明,IcFPS1蛋白質(zhì)屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級(jí)家族,與其他植物尤其是藥用植物的FPS蛋白質(zhì)具有較高的相似性,與五加科的FPS蛋白親緣關(guān)系較近,結(jié)合蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析,證實(shí)枸骨IcFPS1參與類異戊二烯代謝途徑,可能參與調(diào)控枸骨三萜皂苷的生物合成。

    qRT-PCR分析結(jié)果表明IcFPS1基因在枸骨各個(gè)器官組織中的表達(dá)量具有部位差異性,其中在根中的基因表達(dá)量最高,其次是葉,在莖和雌花中表達(dá)量最少,這種現(xiàn)象或許與FPS在三萜皂苷代謝途徑中的功能有關(guān)。目前已在許多植物上進(jìn)行了FPS基因的分離和功能驗(yàn)證。Cunilleraetal.(1996)克隆了擬南芥FPS基因,qRT-PCR分析結(jié)果表明擬南芥FPS1和FPS2基因在幼苗的根、莖、葉和花中都有表達(dá);其中,F(xiàn)PS1基因在根和花中最高表達(dá),F(xiàn)PS2基因表達(dá)水平較低,具有組織表達(dá)差異性,這與我們的研究結(jié)果相似。在白木香FPS基因功能研究中,組織表達(dá)結(jié)果表明FPS基因的表達(dá)量最高是根,其次是莖,表達(dá)量最少的是葉,推測(cè)該基因在根和莖兩個(gè)組織中發(fā)揮生物學(xué)功能,與白木香的形成部位相關(guān)(楊欣等,2013);在人參中,F(xiàn)PS基因表達(dá)分析結(jié)果表明該基因在葉的表達(dá)量最多(楊林林等,2017),這與本文研究中根的表達(dá)量最多不同。在三七FPS基因的功能研究時(shí)發(fā)現(xiàn),在三七細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FPS基因可以促進(jìn)三七總皂苷積累(楊延等,2015)。周秘等(2013)對(duì)刺五加法尼基焦硫酸合酶研究發(fā)現(xiàn),PFS基因刺五加整個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量與其皂苷含量呈現(xiàn)基本相似的變化趨勢(shì),證實(shí)FPS是刺五加三萜皂苷生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。這些結(jié)果表明FPS基因的表達(dá)與三萜化合物的生物合成密切相關(guān)。因此可以推斷,枸骨的IcFPS1基因也可能參與了枸骨三萜類物質(zhì)的生物合成。

    總之,本研究克隆獲得了枸骨的IcFPS1基因,對(duì)其核酸序列和蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè),構(gòu)建了枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò);并分析了IcFPS1基因在枸骨不同組織部位中的表達(dá)水平,該研究為進(jìn)一步弄清IcFPS1基因在枸骨三萜皂苷生物合成中的作用奠定了基礎(chǔ),為提高枸骨三萜皂苷含量提供了一定的理論依據(jù)。

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