黃秋葵根結(jié)線蟲病的病原鑒定

練冬梅 賴正鋒 姚運(yùn)法 洪建基

摘?要：根結(jié)線蟲種類繁多，鑒定黃秋葵根結(jié)線蟲病病原種類，可為黃秋葵根結(jié)線蟲病害防治提供信息基礎(chǔ)，并為今后開展黃秋葵根結(jié)線蟲病的抗病種質(zhì)篩選、抗病育種提供重要理論依據(jù)。從被侵染的黃秋葵根組織中分離雌蟲，并采用形態(tài)學(xué)、同工酶和rDNAITSPCR相結(jié)合的方法鑒定黃秋葵根結(jié)線蟲病病原種類。結(jié)果表明：危害黃秋葵根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita。

關(guān)鍵詞：黃秋葵;根結(jié)線蟲病;病原鑒定

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.010

Abstract：There were many species of rootknot nematodes. Identifying the pathogenic species of rootknot nematode disease on okra can provide information basis for the prevention and control of rootknot nematode disease on okra， and provid important theoretical basis for the selection of diseaseresistant germplasms and diseaseresistant breeding of rootknot nematode disease in the future.The females were isolated from the infected root tissues of okra and the pathogenic species of okra rootknot nematode disease were identified by morphology， isozyme and rDNAITSPCR.The results showed that the rootknot nematodes which harmed okra were Meloidogyne incognita.

Key words：Okra; Rootknot nematode; Pathogen identification

黃秋葵Okra為錦葵科Malvaceae秋葵屬Abelmoschu的一個(gè)種[1]，又名秋葵、補(bǔ)腎草、咖啡葵等。原產(chǎn)于非洲，自20世紀(jì)90年代初引入我國(guó)，現(xiàn)國(guó)內(nèi)各地均有栽培。黃秋葵作為一種特色的保健型蔬菜，種植面積不斷擴(kuò)大，福建漳州地區(qū)每年黃秋葵種植面積累計(jì)達(dá)到1300多hm2，在福建省建寧、泰寧和將樂等諸縣種植的黃秋奏品種洋辣、癡椒也已有百年之久[2]。由于黃秋葵生產(chǎn)規(guī)?；?、設(shè)施化以及連作障礙嚴(yán)重，根結(jié)線蟲病已成為黃秋葵的最重要病害之一，極大地降低了黃秋葵的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。黃秋葵植株根部受根結(jié)線蟲侵染后，側(cè)根和須根上產(chǎn)生根結(jié)，呈串珠狀或雞爪狀，表面粗糙，容易龜裂腐爛。由于根系畸變膨大，導(dǎo)致根部吸收營(yíng)養(yǎng)成分和水分的運(yùn)輸功能遭到破壞，從而引起植株矮化、褪綠、落葉甚至死亡[4]。

我國(guó)已報(bào)道的根結(jié)線蟲種類為57種，其中能引起蔬菜發(fā)生根結(jié)線蟲病的主要為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita[5]、象耳豆根結(jié)線蟲Meloidogyne enterolobii[6]、爪哇根結(jié)線蟲Meloidogyne javanica[7]、北方根結(jié)線蟲Meloidogyne hapla[8]、花生根結(jié)線蟲Meloidogyne arenaria[9]。常規(guī)的根結(jié)線蟲種類鑒定主要通過形態(tài)學(xué)鑒定、鑒別寄主及生化鑒定，近十幾年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為根結(jié)線蟲的準(zhǔn)確鑒定提供了重要手段。根結(jié)線蟲種間存在顯著的致病差異，對(duì)黃秋葵根結(jié)線蟲種類的鑒定是防治根結(jié)線蟲病的重要前提。本研究在福建省漳州市黃秋葵種植區(qū)域監(jiān)測(cè)到黃秋葵根結(jié)線蟲的癥狀，通過病原分離鑒定，確定黃秋葵根結(jié)線蟲種類，為黃秋葵根結(jié)線蟲病的防治提供信息基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

在福建省漳州市采集黃秋葵根結(jié)線蟲發(fā)病植株根系，清洗干凈，挑取根系中淡黃色的單卵塊至1.5 mL離心管中，用1%NaClO溶液消毒5 min后，無(wú)菌水清洗3次，加入無(wú)菌水室溫下孵化24 h后接種于易感黃秋葵上進(jìn)行培養(yǎng)，待后期鑒定。供試爪哇根結(jié)線蟲蟲源由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈(zèng)，并長(zhǎng)期培養(yǎng)保存于易感番茄上。

1.2?病原線蟲的分離與鑒定

1.2.1?會(huì)陰花紋形態(tài)學(xué)鑒定?根結(jié)線蟲接種8周后，取被侵染的黃秋葵根組織進(jìn)行雌蟲分離，分離出的單頭雌蟲，根結(jié)線蟲成熟雌蟲會(huì)陰花紋制作和觀察參照劉維志[10]和趙雷等[11]的方法。

1.2.2?同工酶分析?參照胡凱基[12]的方法，挑取20頭雌幼蟲置于1.5 mL的離心管中，加入15 μL酶浸提液，研碎，將酶提取物加入到7%分離膠、4%濃縮膠、膠厚1.0 mm的膠孔中，運(yùn)用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行同工酶酯酶（EST）分析。電泳結(jié)束后參照胡凱基[12]的方法進(jìn)行EST染色，以已鑒定的爪哇根結(jié)線蟲Meloidogyne javanica為對(duì)照。酯酶表型的判讀按照Esbenshade等[13]的方法。

1.2.3?rDNA的ITS區(qū)PCR鑒定?采用Vrain等[14]設(shè)計(jì)的引物18S（5′TTGATTACGTCCTGC CCCTTT3′）和28S（5′TTTCACTCGTTACTAAGG3′）進(jìn)行rDNAITS擴(kuò)增，引物由上海生工公司合成。將黃秋葵根結(jié)線蟲雌蟲置于200 μL的PCR管中，加入10 μL滅菌水，用10 μL槍頭將雌蟲刺破，內(nèi)含物溢出，再加入8 μL10×PCR Buffer，并且以終度60 μg·mL-1的蛋白酶K處理，之后將樣品置于-70℃30 min，65℃下溫育1 h，95℃10 min，最終常溫下12000 r·min-1離心≥1 min，上清液可作PCR模板。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包含12.5 μL Mix、正反引物各1 μL、線蟲DNA粗提液5 μL，加滅菌水補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)， 72℃充分延伸10 min，4℃保溫。取PCR產(chǎn)物5 μL在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)拍照。剩余PCR產(chǎn)物通過回收、純化、克隆和測(cè)序后于NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?會(huì)陰花紋形態(tài)學(xué)觀察

根結(jié)線蟲雌蟲的會(huì)陰花紋背弓較高，花紋呈橢圓形，背弓由平滑到波浪形的線紋組成，一些線紋在側(cè)面分叉，無(wú)明顯側(cè)線，對(duì)照文獻(xiàn)資料[15]，初步確定黃秋葵根接線蟲為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita。

2.2?同工酶分析結(jié)果

對(duì)純化培養(yǎng)的黃秋葵根結(jié)線蟲雌幼蟲的酯酶進(jìn)行電泳分析。經(jīng)同工酶的特異性染色后，黃秋葵根結(jié)線蟲酯酶譜型為I2型，為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita酯酶譜型。

2.3?rDNAITS分子鑒定結(jié)果

以黃秋葵根結(jié)線蟲粗提液為模板，用引物18S和28S擴(kuò)增rDNA的ITS區(qū)序列。結(jié)果得到ITS片段均為750 bp左右。對(duì)rDNAITS區(qū)序列進(jìn)行克隆與測(cè)序，產(chǎn)物大小為765 bp，將測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行分析，與已知Meloidogyne incognita ITS區(qū)編碼序列相似性達(dá)到99%，由此確定黃秋葵根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita。

3?討論與結(jié)論

黃秋葵是兼食用和觀賞的作物，由于根結(jié)線蟲病是一種隱蔽性強(qiáng)的植物病害，不易被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，所以根結(jié)線蟲侵染后往往導(dǎo)致黃秋葵產(chǎn)量大大降低，植株葉片發(fā)黃而失去觀賞價(jià)值。因此，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步廣泛、深入地開展黃秋葵根結(jié)線蟲病的研究，為黃秋葵育種和根結(jié)線蟲病防治提供技術(shù)支持。目前國(guó)內(nèi)天津地區(qū)為害黃秋葵的根結(jié)線蟲種類是南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita[16]，國(guó)外也有報(bào)道[3]為害黃秋葵的根結(jié)線蟲種類是南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita和象耳豆根結(jié)線蟲Meloidogyne enterolobii。由于寄主及環(huán)境條件的差異，根結(jié)線蟲形態(tài)上會(huì)存在著一定的變異。形態(tài)特征較多依賴雌蟲會(huì)陰花紋的觀察，表型判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)常見根結(jié)線蟲種群鑒定準(zhǔn)確而有效，rDNAITSPCR技術(shù)是通過對(duì)區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序獲得的序列與已知線蟲序列進(jìn)行對(duì)比，從而獲得未知線蟲屬信息的方法，該方法在根結(jié)線蟲上已得到廣泛應(yīng)用。因此本研究利用會(huì)陰花紋形態(tài)學(xué)、同工酶分析和分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法對(duì)黃秋葵病原線蟲進(jìn)行種類鑒定，發(fā)現(xiàn)黃秋葵根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）