利用分子標(biāo)記輔助選擇改良蜀恢527對(duì)白葉枯病的抗性

顧建強(qiáng) 陳子強(qiáng) 林艷 郭新睿 田大剛

摘?要：分子標(biāo)記輔助選擇可快速實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的準(zhǔn)確選擇，為分子育種提供有效工具。以雜交水稻恢復(fù)系蜀恢527為受體親本，以攜帶抗白葉枯病抗性基因Xa23的IRBBL23為供體親本，利用雜交、回交育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇的方法，將廣譜持久抗白葉枯病基因Xa23導(dǎo)入到優(yōu)良恢復(fù)系蜀恢527中， 獲得22份含有Xa23基因的改良株系。用白葉枯病菌致病菌系P6接種改良株系，篩選出1份高抗白葉枯病的新恢復(fù)系R527Xa23。進(jìn)一步考察R527Xa23與不育系谷A、Ⅱ32A和特豐A配制雜交組合的農(nóng)藝性狀，結(jié)果顯示R527Xa23與蜀恢R527的組合，在穗長、每株穗數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等相關(guān)農(nóng)藝性狀上相似，表明該恢復(fù)系R527Xa23在培育白葉枯病抗性雜交水稻組合上具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：水稻;蜀恢527;白葉枯病;Xa23;分子標(biāo)記輔助選擇

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.03.002

Abstrat：Molecular markerassisted selection can achieve accurate selection of target genes quickly and provides an effective tool for molecular breeding. Using restorer line Shuhui 527 as receptor parent and IRBBL23， which carrying Xa23， a resistance gene to bacterial blight， as donor parent， the broadspectrum and persistently resistant gene Xa23 was introduced into the restorer line Shuhui 527 by crossing and backcross breeding combined with molecular markerassisted selection， 22 improved lines containing Xa23 gene were obtained. A New Restorer Line R527Xa23 with high resistance to bacterial blight was screened by inoculating the improved strain P6. The agronomic traits of hybrid combinations from R527Xa23 and sterile lines Gu A， Ⅱ32A and Tefeng A were further investigated. The results showed that the improved combinations of R527Xa23 and Shuhui R527 had similar agronomic traits in panicle length， number of panicles per plant and 1000grain weight， which indicated that the restorer line R527Xa23 had broad application prospects in breeding hybrid rice combinations that resistant to bacterial blight.

Key words：Rice; Shuhui 527; Bacterial blight; Xa23; Molecular markerassisted selection

水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性菌稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo）引起的一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，一般會(huì)造成水稻減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)到50%，甚至顆粒無收[1]。此病害在世界各水稻產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，尤其在中國、日本和印度發(fā)生最為嚴(yán)重[2]。這給水稻生產(chǎn)帶來了巨大風(fēng)險(xiǎn)。目前生產(chǎn)上使用化學(xué)農(nóng)藥防治白葉枯病不僅成本高、效果差，還存在嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境等問題。長期生產(chǎn)實(shí)踐表明，利用白葉枯病抗性基因培育抗病品種，是解決上述問題的有效措施。

截至2013年3月，經(jīng)國際注冊確認(rèn)和報(bào)道的水稻白葉枯病抗性基因共38個(gè)。已被定位的抗性基因有26個(gè)，已有7個(gè)基因被成功克隆[3]。Xa23是一個(gè)廣譜持久抗水稻白葉枯病基因，其對(duì)現(xiàn)有國內(nèi)外白葉枯病鑒別菌系（如菲律賓小種1～10、中國致病型小種1～7和日本小種1～3）都表現(xiàn)高抗，且完全顯性、全生育期抗病[4]。迄今，該基因已被廣泛應(yīng)用于雜交稻白葉枯病抗性改良[5-10]。

本研究以不抗白葉枯病的恢復(fù)系蜀恢527為受體材料，利用回交轉(zhuǎn)育技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇，將抗病基因Xa23導(dǎo)入到該恢復(fù)系中。隨后，對(duì)改良株系及其所配制雜交組合進(jìn)行抗性和產(chǎn)量評(píng)價(jià)，以期利用改良的恢復(fù)系和不育系配制雜交組合，培育高抗白葉枯病的優(yōu)良雜交稻。

1?材料與方法

1.1?材料

供體親本：攜有Xa23基因的IRBBL23;受體親本：恢復(fù)系蜀恢527;鑒定菌系：水稻白葉枯病鑒別菌系P6。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?將Xa23基因?qū)胧荏w材料技術(shù)路線?以恢復(fù)系蜀恢527為受體親本，以IRBBL23為抗體基因供體親本配制水稻雜交組合，F(xiàn)1自交，與輪回親本蜀恢527進(jìn)行回交。連續(xù)3次回交和1次自交獲得分離群體，利用已開發(fā)的EST分子標(biāo)記C189對(duì)分離群體進(jìn)行篩選，得到含有目的基因Xa23的抗性單株。

1.2.2?抗病基因的檢測?水稻基因組DNA提取參考張鳳娟等的方法[11]。利用王春連等開發(fā)的EST標(biāo)記C189[9]（引物序列由福州擎科生物技術(shù)有限公司合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為25 μL，包括2×reaction Mix（含dNTP，Mg2+）12.5 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）1 μL，Gloden Taq polymerase（5 U·μL-1）0.4 μL（天根公司），水稻基因組DNA

（20～30 ng·μL-1）1 μL，ddH2O 9.1 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸40 s;共35個(gè)循環(huán);最終72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.2.3?病原菌接種鑒定?將白葉枯病菌強(qiáng)致病菌系P6接種在馬鈴薯半合成培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)72 h，用無菌水洗下菌苔并將菌液稀釋至6×108 CUF·mL-1。在水稻孕穗期，采用剪葉法進(jìn)行人工接種菌株。每株材料選擇5片葉接種，接種后2～3周進(jìn)行調(diào)查。根據(jù)《中國水稻品種試驗(yàn)與審定》中主要病害鑒定方法與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行材料抗性評(píng)價(jià)[12]。

1.2.4?室內(nèi)考種?配制的雜交組合按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)排列種植福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所壽山試驗(yàn)站，每小區(qū)種植4行，每行8株，3次重復(fù)。參考許桂玲等[13]的方法進(jìn)行室內(nèi)考種。

2?結(jié)果與分析

2.1?抗性基因Xa23的檢測分析

利用抗性基因Xa23的緊密連鎖分子標(biāo)記C189對(duì)BC3F2群體單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，供體親本擴(kuò)增出約800 bp的Xa23特征條帶，而受體親本擴(kuò)增出約900 bp的條帶，BC3F2的部分單株擴(kuò)增出含Xa23的特征條帶，說明抗白葉枯病基因Xa23被成功導(dǎo)入到恢復(fù)系蜀恢527中。在BC3F2群體中，共檢測出22份攜帶Xa23的純合株系。

2.2?病原菌接種鑒定分析

將22份改良株系和親本在孕穗期接種本試驗(yàn)的白葉枯病菌系P6，劍葉剪葉接種水稻白葉枯病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。接種鑒定結(jié)果顯示，親本蜀恢527對(duì)白葉枯病表現(xiàn)感或中感，而絕大多數(shù)攜有抗性基因Xa23的改良系和供體親本表現(xiàn)抗白葉枯病，其中1份編號(hào)為R527Xa23的材料表現(xiàn)高抗白葉枯病。

2.3?雜交組合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

用三系不育系谷豐A、Ⅱ32A和特豐A作母本，分別與純合的R527Xa23和對(duì)照蜀恢527配制雜交組合?？疾熳匀徊话l(fā)病條件下6個(gè)組合的穗長、有效穗數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等4個(gè)農(nóng)藝性狀，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？傮w看來，R527Xa23與不育系谷豐A配制的雜交組合，在穗長、每株穗數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重上與對(duì)照差異不顯著，且表現(xiàn)出良好的恢復(fù)性能（表2）。而對(duì)于Ⅱ32A/R527Xa23和特豐A/R527Xa23，其分別在結(jié)實(shí)率和千粒重上高于對(duì)照，達(dá)到顯著水平。調(diào)查結(jié)果表明恢復(fù)系R527Xa23在培育白葉枯病抗性雜交水稻組合上具有廣闊的應(yīng)用前景。

3?討論與結(jié)論

防治水稻白葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效的手段就是利用白葉枯病抗性基因培育抗病品種，包括Xa1、Xa3/Xa26、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25 和Xa27。其中，Xa23是從我國普通野生稻種鑒定出的一個(gè)優(yōu)良抗白葉枯病基因，具有抗譜廣、抗性導(dǎo)入效應(yīng)強(qiáng)、完全顯性和全生育期抗性等特點(diǎn)。因此，該基因成為我國在雜交稻白葉枯病抗性改良上一個(gè)主要基因資源。

目前，水稻抗病育種通常是采用傳統(tǒng)育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)水稻品種進(jìn)行改良。相比傳統(tǒng)抗性育種利用人工接種或發(fā)病區(qū)鑒定篩選目標(biāo)植株，該方法具有低資源投入，且不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的改良目標(biāo)性狀。利用這項(xiàng)技術(shù)成功地培育出一批含Xa23優(yōu)良品系，并育成了一系列雜交組合。如：利用分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)將Xa23成功導(dǎo)入到閩恢3139[5]，9311、1826[6]，早稻恢復(fù)系東南恢01[10]，培矮64S、明恢86和C418[14]和HK01[15]，并顯著提高改良品系對(duì)白葉枯病的抗性。

蜀恢527（R527）是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所育成的一個(gè)強(qiáng)恢復(fù)系，具有株葉形態(tài)好、恢復(fù)力強(qiáng)、配合力高、品質(zhì)優(yōu)、較抗稻瘟病等特點(diǎn)，其已配組出通過全國或省級(jí)審定的多種組合[16]。然而，由于蜀恢527本身及其所采用的不育系都不抗白葉枯病，限制其大面積推廣和應(yīng)用。目前，黃廷友等[17]利用分子標(biāo)記輔助選擇已成功將Xa21和Xa4導(dǎo)入蜀恢527，達(dá)到改良其抗白葉枯病的目的。而本研究基于Xa23與Xa21、Xa4抗譜的差異，以及Xa23廣闊的應(yīng)用前景，通過傳統(tǒng)抗病育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇的方法，在相對(duì)較短的年限內(nèi)獲得了具有高抗白葉枯病的新的恢復(fù)系R527Xa23，而且該恢復(fù)系表現(xiàn)出與蜀恢527相似的農(nóng)藝性狀。新材料R527Xa23可作為優(yōu)良的恢復(fù)系用于水稻生產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）