香菇菌株LE08液體發(fā)酵及多糖提取工藝的優(yōu)化

黃蓓蓓，王永志

(1.河南科技大學 應用工程學院 食品工程系， 河南 三門峽 472000；2.三門峽職業(yè)技術學院 食品園林學院，河南 三門峽 472000)

1 概述

香菇[Lentinulaedodes(Berk.)Pegler]，隸屬于多孔菌科(Polyporaceae)、香菇屬(Lentinula)[1]。香菇的肉質鮮美、味道獨特，具有較高的食用和藥用價值。目前香菇鮮品、干品、醬料已經成為人們日常生活中不可缺少的烹飪用料[2-4]。我國是較早進行香菇人工栽培的國家[5]。香菇的營養(yǎng)豐富，富含多種氨基酸、維生素和礦物質。除此之外，香菇還含有極高的不飽和脂肪酸、麥角甾醇、菌甾醇、香菇肽和酪氨酸氧化酶。麥角甾醇可轉化為維生素D，能增強人體機能；而香菇肽和酪氨酸氧化酶可起到降血壓的作用。研究表明，香菇中的活性物質多糖能改善機體代謝、調節(jié)免疫、抗腫瘤、增強免疫能力、抗衰老和抗氧化[6]。

有關香菇液體發(fā)酵的研究主要集中于對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化問題上，大多報道多以香菇菌絲體的生物量為指標[7-13]。韓冰等通過探究香菇菌株遼香6號的最佳液體深層發(fā)酵實驗，發(fā)現最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為：紅糖1%、玉米粉2%、酵母粉1%、麩皮2%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%[14]。李春霞等以香菇0912號為供試菌株，探究不同養(yǎng)分和條件下對菌絲體干質量的影響，結果表明影響香菇菌絲干質量的因素為葡萄糖、玉米漿、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀[15-16]。

傳統(tǒng)香菇多糖的提取是從子實體中獲得的，然而香菇子實體的生長周期較長，受季節(jié)和環(huán)境的限制，其生產效率較低[17-19]。香菇液體發(fā)酵技術具有周期短、成本低、產量大、可工業(yè)化生產等特點[20]。目前對于香菇液體發(fā)酵條件的研究仍不夠深入，液體發(fā)酵所得的多糖產量普遍不高[21-23]。不同產區(qū)的香菇菌種，其液體發(fā)酵的條件也不盡相同[24]，本文通過對香菇液體發(fā)酵的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，同時也對發(fā)酵液中多糖提取的工藝進行了探究，為香菇液體發(fā)酵的工廠化生產奠定了一定的基礎[25]。

2 材料與方法

2.1 實驗菌種

香菇菌株LE08為本實驗室自行分離于野生香菇子實體而得，菌株保藏于本實驗室。

2.2 實驗試劑

玉米粉、單糖、麥麩、酵母膏、多糖、硫酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉和硝酸銨。

2.3 實驗儀器

培養(yǎng)箱、無菌工作臺、滅菌鍋、500 mL三角瓶、搖床、1000 mL燒杯、注射器、天平、離心機和pH計。

2.4 培養(yǎng)基

2.4.1 基礎培養(yǎng)基

土豆培養(yǎng)基：土豆20 g，糖2.0 g，瓊脂1.8 g，純凈水1000 mL。

2.4.2 種子培養(yǎng)基

土豆20 g，糖2.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，純凈水1000 mL。

2.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖2.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，無菌水1000 mL。

2.5 實驗方法

2.5.1 香菇菌種活化

在超凈工作臺內，用無菌接種鏟從香菇菌株LE08的母管斜面試管內取1 cm3的菌塊，接種于PDA上，并在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，定時觀察菌絲的生長狀態(tài)，待菌絲長滿試管后，便可進行后續(xù)實驗。

2.5.2 搖瓶種子液和香菇發(fā)酵液的制備

在超凈工作臺中，用無菌接種鏟從已活化的菌株LE08的PDA斜面試管中鏟取6塊大小為1 cm3的菌塊，分別接種于裝有100 mL種子液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶3塊菌塊。將接種好的三角瓶放置于搖床中，溫度調整為25 ℃，轉速為160 r/min，培養(yǎng)7～10 d。

LE08菌株的液體菌種制作結束后，在無菌工作臺中，將種子液轉接于液體發(fā)酵的三角瓶中，裝液量共為100 mL。將接種好的三角瓶置于搖床中，溫度為25 ℃，轉速為180 r/min，培養(yǎng)至發(fā)酵終點。

2.5.3 最佳碳源、氮源和無機鹽篩選

供試碳源為玉米粉、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖；碳源篩選培養(yǎng)基：蛋白胨1.5%、碳源2.0%和磷酸二氫鉀0.06%。

供試氮源為硝酸銨、麥麩、蛋白胨和酵母膏；氮源篩選培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、氮源1.5%和磷酸二氫鉀0.06%。

供試無機鹽為硫酸鎂、硫酸鈣、磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉；無機鹽篩選培養(yǎng)基：無機鹽0.06%、葡萄糖2.0%和蛋白胨1.5%。

按照上述配方，分別配制用于篩選碳源、氮源和無機鹽的發(fā)酵液，接種已培養(yǎng)好的香菇種子液10 mL，培養(yǎng)至發(fā)酵終點后分別測定不同碳源、氮源和無機鹽對香菇發(fā)酵液中多糖產量的影響。

2.5.4 正交實驗設計

本文篩選對香菇發(fā)酵液中多糖產量影響較大的因子：蛋白胨、葡萄糖和磷酸二氫鉀，進行三水平三因素的正交實驗，見表1。

表1 正交實驗因素以及水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

2.5.5 醇沉法提取發(fā)酵液中的多糖

按照已經篩選出的最佳碳源、氮源和無機鹽配方，配制香菇液體發(fā)酵液，方法參考2.5.2。將充分發(fā)酵的液體離心處理，取上清液，再經0.20 μm濾膜過濾，放置于4 ℃保存，備用。

2.5.6 乙醇加入量對香菇液體發(fā)酵液中多糖提取的影響

取50 mL上述制備好的香菇發(fā)酵液于燒杯中，調節(jié)pH值為7，分別按照表2的體積比例加入無水乙醇。在室溫條件下放置24 h，離心并收集沉淀，干燥后稱重，計算香菇發(fā)酵液中的多糖含量。

表2 醇沉法提取多糖中無水乙醇的添加量Table 2 The additive amount of absolute ethanol in polysaccharide extracted by alcohol precipitation method mL

2.5.7 醇沉時間對香菇液體發(fā)酵液中多糖提取的影響

取50 mL香菇發(fā)酵液于燒杯中，調節(jié)pH值為7，添加無水乙醇150 mL。在室溫條件下，分別靜置12，24，36 h后經離心收集沉淀，干燥、稱重、計算香菇發(fā)酵液中的多糖含量。

3 結果與分析

3.1 不同碳源對香菇液體發(fā)酵的影響

圖1 不同碳源對香菇發(fā)酵液中多糖產量的影響Fig.1 The effect of different carbon sources on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

本研究為考察不同碳源對香菇液體發(fā)酵的影響，選取4種碳源，分別為麥芽糖、玉米粉、蔗糖和葡萄糖，其添加濃度均為2.0%。由圖1可知，碳源的種類不同，香菇發(fā)酵液中香菇多糖產量也不相同。當以葡萄糖為碳源時，香菇發(fā)酵液所產的香菇多糖量最高，達1.31 g/L,其次是蔗糖和麥芽糖，多糖產量最低的碳源為玉米粉。由此說明葡萄糖為香菇液體發(fā)酵的最適宜碳源。

3.2 不同氮源對香菇液體發(fā)酵的影響

圖2 不同氮源對香菇發(fā)酵液中多糖產量的影響Fig.2 The effect of different nitrogen sources on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

本實驗選取了4類氮源麥麩、硝酸銨、蛋白胨、酵母膏，添加濃度均為1.0%。探究在不同氮源條件下，香菇液體發(fā)酵液中多糖產量的變化。麥麩、蛋白胨和酵母膏為有機氮源，硝酸銨為無機氮源。由圖2可知，使用有機氮源(麥麩、蛋白胨和酵母膏)時，香菇發(fā)酵液中的多糖含量較高，其中以蛋白胨為氮源時，香菇發(fā)酵液中的多糖產量最高，為1.49 g/L；以硝酸銨為氮源時，香菇發(fā)酵液中的多糖產量僅為0.54 g/L。由此表明香菇液體發(fā)酵的最適氮源為蛋白胨。

3.3 不同無機鹽對香菇液體發(fā)酵的影響

圖3 不同無機鹽對香菇發(fā)酵液中多糖產量的影響Fig.3 The effect of different inorganic salts on the yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

3種無機鹽硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣的添加濃度均為0.06%。由圖3可知，以磷酸二氫鉀為無機鹽時，香菇液體發(fā)酵液中的多糖含量最高，多糖產量高達1.31 g/L，說明磷酸二氫鉀對香菇多糖的合成具有促進作用。

3.4 正交實驗結果

由上述單因素實驗結果可知，適合香菇液體發(fā)酵的最佳碳源、氮源和無機鹽分別為葡萄糖、蛋白胨和磷酸二氫鉀。在此條件下，按照表1進行三因素三水平的正交實驗，結果見表3。

表3 葡萄糖、蛋白胨和磷酸二氫鉀三因素三水平的正交實驗結果Table 3 Three-factor and three-level orthogonal experimental results of glucose, peptone and monopotassium phosphate

由表3可知，A2B2C3組合的結果最好，并且蛋白胨對香菇液體發(fā)酵多糖產量的影響最大，磷酸二氫鉀次之，葡萄糖的影響最小。確定香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、磷酸二氫鉀0.07%。在此條件下，香菇液體發(fā)酵多糖的產量為1.68 g/L。

3.5 無水乙醇加入量對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響

圖4 乙醇的添加量對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響Fig.4 The effect of ethanol additive amount on the extraction yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

由圖4可知，當無水乙醇的添加量小于或等于150 mL時，香菇液體發(fā)酵液中的多糖提取量隨著乙醇添加量的增大而增大；當無水乙醇的添加量大于150 mL時，其多糖提取量隨著乙醇添加量的增大而逐漸下降。當乙醇添加量與發(fā)酵液量的體積比為3∶1時，本文中乙醇的添加量為150 mL，發(fā)酵液量為50 mL，香菇液體發(fā)酵液中的多糖提取量最高，達1.56 g/L。

3.6 醇沉時間對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響

圖5 醇沉時間對香菇發(fā)酵液中多糖提取量的影響Fig.5 The effect of alcohol precipitation time on the extraction yield of polysaccharides in the fermentation liquid of Lentinus edodes

由圖5可知，醇沉時間在24 h時，香菇菌株LE08的發(fā)酵液中多糖的提取量最高，為1.61 g/L，而醇沉時間大于24 h時，其多糖提取量并無顯著性增加，因此醇沉法中最佳醇沉時間為24 h。由于本實驗選取的時間周期較大，因此不能確定在醇沉12 h和24 h之間的多糖含量變化，后續(xù)實驗可有針對性地探究最佳的醇沉時間，以確保減少醇沉時間。

4 結論

本文初步研究了適合香菇LE08號菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)基以及提取發(fā)酵液中多糖成分的最佳醇沉工藝。通過單因素和正交實驗，確定了發(fā)酵液中的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，最佳無機鹽是磷酸二氫鉀。最佳培養(yǎng)基制作方案為：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.5%、磷酸二氫鉀0.07%時，此時香菇液體發(fā)酵多糖的產量最高。在探究醇沉法提取香菇發(fā)酵液中的多糖工藝時，確定了最佳的無水乙醇添加量為發(fā)酵液體積的3倍，醇沉時間為24 h。后續(xù)的實驗可集中于不同提取方法對香菇發(fā)酵液中多糖活性的影響，為香菇液體發(fā)酵的工廠化應用提供了理論依據。