基于拉曼光譜和自熒光光譜的柑橘黃龍病快速檢測(cè)方法

代芬 邱澤源 邱倩 劉楚健 黃國(guó)增 黃雅琳 鄧小玲

摘? ?要：為了快速檢測(cè)黃龍病這一柑橘毀滅性病害，分析了柑橘黃龍病樣本和健康樣本的自熒光和拉曼光譜差異，建立了基于自熒光光譜、拉曼光譜和混合光譜的PLS-DA模型，進(jìn)行了模型的結(jié)果比較，最后繪制了三種模型的分類(lèi)器特征曲線ROC，通過(guò)曲線下面積AUC參數(shù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了模型的性能。試驗(yàn)結(jié)果表明，柑橘黃龍病葉片樣本和健康葉片樣本的自熒光光譜和拉曼光譜存在差異信息。在785nm波長(zhǎng)激光誘導(dǎo)下，柑橘葉片樣本都產(chǎn)生了比較強(qiáng)的自熒光。黃龍病葉片的自熒光相對(duì)于健康樣本的自熒光在小于1203cm-1范圍更弱，而在大于1206cm-1范圍更強(qiáng)，其下降的斜率（絕對(duì)值）相對(duì)健康樣本更小。在典型的黃龍病樣本和健康樣本的拉曼光譜數(shù)據(jù)中，均可發(fā)現(xiàn)具有以下拉曼峰且具有一致性：920cm-1，1160cm-1，1289cm-1，1331cm-1和1529cm-1。黃龍病樣本和健康樣本相比在1257cm-1、1396cm-1、1446cm-1、1601 cm-1和1622cm-1具有更大的拉曼峰值強(qiáng)度和光譜帶寬，在1006cm-1、1160cm-1、1191cm-1和1529cm-1位置譜峰強(qiáng)度較弱，提示黃龍病樣本的類(lèi)胡蘿卜素含量較低?；谧詿晒夤庾V、拉曼光譜和混合光譜三種光譜的PLS-DA模型鑒別的準(zhǔn)確率分別為86.08%、98.17%和94.75%。進(jìn)一步計(jì)算三種模型的ROC曲線下面積AUC參數(shù)分別為0.9313、0.9991和0.9875，拉曼光譜模型的AUC值最大，也表明拉曼光譜模型的鑒別效果最優(yōu)。拉曼光譜分析技術(shù)可以成為探索柑橘黃龍病快速診斷鑒別的新途徑。

關(guān)鍵詞：黃龍病檢測(cè);拉曼光譜;自熒光光譜;PLS-DA;柑橘;診斷

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：201812-SA026

代? ?芬，邱澤源，邱? ?倩，劉楚健，黃國(guó)增，黃雅琳，鄧小玲. 基于拉曼光譜和自熒光光譜的柑橘黃龍病快速檢測(cè)方法[J].智慧農(nóng)業(yè)，2019，1（3）： 77-86.

Dai F， Qiu Z， Qiu Q， Liu C， Huang G， Huang Y， Deng X. Rapid detection of citrus Huanglongbing using Raman spectroscopy and Auto-fluorescence spectroscopy[J]. Smart Agriculture， 2019， 1（3）： 77-86. （in Chinese with English abstract）

1? 引言

柑桔黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是柑桔的毀滅性病害[1]。其發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為患病植株長(zhǎng)勢(shì)衰退，抽梢短而小，樹(shù)葉出現(xiàn)斑駁性黃化和整體黃化枯萎，植株果實(shí)變小且果柄端橘紅色，其余部分青色，俗稱紅鼻子果[2]。目前柑橘黃龍病診斷有田間診斷、嫁接診斷、電鏡觀察、血清學(xué)診斷、DNA（Deoxyribonucleic Acid）探針雜交以及聚合酶鏈?zhǔn)矫阜磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增等方法[2]。黃龍病檢測(cè)目前存在的主要問(wèn)題是癥狀非常復(fù)雜，肉眼鑒別易混淆[3];電鏡檢測(cè)病菌分布不均，易漏檢[4];免疫學(xué)檢測(cè)因克隆抗體專一性強(qiáng)，難以適應(yīng)變異菌株，也易漏檢[5]。目前最有效的PCR方法，耗時(shí)并且費(fèi)用昂貴，難以普及應(yīng)用。針對(duì)該病目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)抗病品種和特效藥劑，柑橘感染黃龍病后，輕者嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)，重者則造成柑橘樹(shù)枯死。目前病害主要靠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)和及時(shí)挖除病樹(shù)來(lái)防止傳播[6]。因此，探索一種適用于柑桔黃龍病早期快速檢測(cè)的新方法顯得尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)黃龍病的快速檢測(cè)已經(jīng)取得了部分研究進(jìn)展。Alireza等[7]利用視覺(jué)傳感器對(duì)90個(gè)柑橘葉片樣本進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果表明90個(gè)樣本均能正確判別，且在591nm處的窄帶偏振照明診斷準(zhǔn)確性顯著提高，達(dá)到無(wú)損診斷黃龍病的目的。此后，Alireza和Won[8]使用偏振光學(xué)成像追蹤黃龍病陽(yáng)性葉片上形成黃色島狀淀粉沉積狀況，以平均灰度值指示淀粉積累的程度，結(jié)果表明該方法能成功檢測(cè)葉片任何部位圖像灰度值的增加。他們還采用由高靈敏度單色相機(jī)、窄帶高功率LED和偏振濾光片構(gòu)成的傳感器，通過(guò)比較柑橘葉片的灰度值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，區(qū)分黃龍病癥狀與缺鋅的視覺(jué)類(lèi)似癥狀，檢測(cè)精度高達(dá)95.5%～98.5%[9]。Kumar等[10]通過(guò)高光譜成像軟件（ENVI，ITT VIS）對(duì)光譜范圍為400～1000nm的航空高光譜圖像進(jìn)行分析處理，將切片隨機(jī)分成訓(xùn)練（70%）和驗(yàn)證（30%）數(shù)據(jù)集，光譜圖表明冠層中心的黃龍病感染可以與健康對(duì)應(yīng)物明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)，總體準(zhǔn)確度可達(dá)60%以上。Deng等[11]采用基于圖像特征提取和兩階段反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Back-Propagation neural network，BPNN）建模方法檢測(cè)柑橘黃龍病，鑒別精度可達(dá)92%。Sindhuja等[12]利用波長(zhǎng)范圍為350～2500nm，并具有989個(gè)光譜特征的近紅外光譜，基于分類(lèi)類(lèi)比軟獨(dú)立建模（Soft Independent Modeling of Classification Analogies， SIMCA）模型對(duì)黃龍病進(jìn)行分類(lèi)，準(zhǔn)確率達(dá)約92%，漏檢率小于3%。Li等[13]通過(guò)機(jī)載高光譜成像的擴(kuò)展光譜角度映射檢測(cè)柑橘黃龍病，檢測(cè)精度達(dá)到86%。

拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)是一種無(wú)損光學(xué)技術(shù)，它易于操作，能探測(cè)組織中的分子和生物化學(xué)變化，而且能夠在生物體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)[14]。研究報(bào)道表明，因?yàn)槿~片中淀粉降解通路上關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，感染黃龍病的柑橘樹(shù)（有癥狀和無(wú)癥狀）都在細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)中有淀粉顆粒非典型積累的現(xiàn)象：一些糖類(lèi)如蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖分布和濃度不平衡，濃度轉(zhuǎn)變，以及植物激素合成異常;而未感染黃龍病的沒(méi)有出現(xiàn)這些異常[15]。前人采用的光學(xué)方法具有快速、無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)，但也存在不足，如近紅外光譜存在檢測(cè)限高、光譜譜峰歸屬不明確，檢測(cè)精度有待進(jìn)一步提高等問(wèn)題。拉曼技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有兩點(diǎn)，一是靈敏度高，二是具有比較明確的指示性，拉曼峰可以明確指示化學(xué)鍵，從而能夠?qū)μ禺愋晕镔|(zhì)起到指示作用[16]。

本文研究了利用自熒光光譜、拉曼光譜以及混合光譜快速檢測(cè)黃龍病的方法，并比較三種光譜在柑橘黃龍病診斷上的準(zhǔn)確性，以探索一種適用于柑桔黃龍病早期快速檢測(cè)的新方法。

2? 材料與方法

2.1? 光譜采集設(shè)備

本研究采用微區(qū)激光拉曼光譜儀（Finder One，卓立漢光公司，北京）進(jìn)行樣本拉曼光譜采集，如圖1所示。

采用785nm波長(zhǎng)激光器（最大輸出：100mw），拉曼光譜范圍為180～5000cm-1，分辨率≤2cm-1，采用TE深制冷型背感光CCD（Charge-Coupled Device），有效像元為2000×256（像元尺寸15μm×15μm）。系統(tǒng)的控制由個(gè)人計(jì)算機(jī)執(zhí)行，采用專用拉曼光譜數(shù)據(jù)成像分析軟件FlexScan采集，顯示和記錄樣本的實(shí)時(shí)拉曼光譜數(shù)據(jù)。

2.2? 試驗(yàn)樣本

試驗(yàn)樣本為砂糖橘果樹(shù)葉片，于2017年5月18日采集于廣東省惠州市博羅縣柑橘黃龍病防控示范基地。選取有明顯癥狀（黃梢和葉片斑駁黃化）果樹(shù)10棵和無(wú)癥狀果樹(shù)10棵，在每棵樹(shù)的底部位置摘取癥狀典型的老葉，共取得219片葉片樣本。樣本采集后用密封袋包裝，24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行拉曼光譜采集，每片葉片在頁(yè)面采集2個(gè)點(diǎn)（如圖2所示），共得到438個(gè)光譜數(shù)據(jù)。最后所有樣本送華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘黃龍病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，確定110個(gè)患病葉片，109個(gè)健康葉片。

2.3? 拉曼光譜數(shù)據(jù)采集

柑橘樹(shù)葉樣本采用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)電子工程學(xué)院購(gòu)置的微區(qū)激光拉曼光譜儀器（如圖3所示）采集光譜數(shù)據(jù)，將樣本置于10倍放大鏡觀察，激光功率為43mW。每片葉片采集兩個(gè)點(diǎn)，避開(kāi)葉脈。采用累積掃描的方法，每個(gè)樣本點(diǎn)曝光6次，每次5s，最終得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)為6次掃描結(jié)果的疊加，并以*.txt格式文件保存為一個(gè)光譜數(shù)據(jù)。最終得到220個(gè)患病葉片的光譜數(shù)據(jù)和218個(gè)健康葉片的光譜數(shù)據(jù)。

2.4? 基于PLS-DA的拉曼光譜和自熒光光譜的黃龍病診斷模型

本試驗(yàn)主要采用偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）來(lái)建立判別模型。PLS-DA是描述預(yù)測(cè)變量集合X上分類(lèi)變量類(lèi)別的二元變量集合Y的偏最小二乘回歸。它是通常判別分析和對(duì)預(yù)測(cè)變量重要主成分的判別分析之間的折中。這種技術(shù)特別適合處理大量的預(yù)測(cè)因子。PLS回歸的目標(biāo)是在將一組響應(yīng)變量Y與一組預(yù)測(cè)變量X相關(guān)聯(lián)的情況下提供降維策略。光譜分析的流程如圖3所示。

為了檢測(cè)和分析譜峰，需要先對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行插值計(jì)算。本研究將采集到的拉曼光譜數(shù)據(jù)使用三次樣條插值（Cubic Spline Interpolation）方法進(jìn)行插值處理，具體處理過(guò)程如下：

假定有n+1個(gè)數(shù)據(jù)節(jié)點(diǎn) ，

計(jì)算步長(zhǎng)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?，將數(shù)據(jù)節(jié)點(diǎn)和指定的首位端點(diǎn)條件帶入矩陣方程，解矩陣方程，求得二次微分值mi，計(jì)算樣條曲線的系數(shù)：

（1）

（2）

（3）

（4）

其中? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?;ai、bi、ci和di是分別是三次樣條插值中常數(shù)項(xiàng)、一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和三次項(xiàng)的系數(shù)。最后在每個(gè)子區(qū)間? ? ? ? ? ? ? ? ? ?中創(chuàng)建方程：

（5）

插值預(yù)處理之后再對(duì)積分時(shí)間和激光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化，提取指紋譜區(qū)，然后使用7次多項(xiàng)式對(duì)光譜曲線進(jìn)行擬合并進(jìn)行迭代減法，最終分離出自熒光光譜和拉曼光譜。

3? 結(jié)果與討論

在采集到的219片葉片上，避開(kāi)葉脈位置，每片采集兩個(gè)點(diǎn)的光譜，一共得到438個(gè)光譜數(shù)據(jù)。插值處理后的全部樣本（包括健康和患有黃龍?。┑钠骄庾V如圖4所示，圖中實(shí)線表示平均值，灰色陰影代表平均值±1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。從圖4中可見(jiàn)，所有的柑橘葉片樣本在785nm的激光誘導(dǎo)下都產(chǎn)生了較強(qiáng)的自熒光和拉曼峰，這為下一步的自熒光分析和拉曼光譜分析提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.1? 自熒光光譜及建模分析

激光誘導(dǎo)熒光是介質(zhì)受到激光激發(fā)后，先由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后處于激發(fā)態(tài)的分子通過(guò)弛豫再下降到基態(tài)的過(guò)程中，以光量子的形式釋放出它所吸收的能量。由于每種物質(zhì)的能級(jí)結(jié)構(gòu)不同，因此，其發(fā)射熒光的特性也不同，通過(guò)對(duì)熒光特性參量的測(cè)量，可以區(qū)分不同物質(zhì)的種類(lèi)。如圖5所示，在785nm波長(zhǎng)激光誘導(dǎo)下，柑橘葉片樣本產(chǎn)生了比較強(qiáng)的熒光，即自熒光?；疾∪~片出現(xiàn)的黃化等癥狀導(dǎo)致其葉綠素含量較低，使得健康葉片的自熒光光譜在小于1203cm-1范圍更強(qiáng)，在大于1206cm-1范圍更弱，其下降的斜率（絕對(duì)值）更大，和患病葉片的自熒光光譜產(chǎn)生了差異。

在分類(lèi)問(wèn)題中，PLS-DA采用了PCA的基本原理，通過(guò)使光譜變量x和分類(lèi)矩陣y之間的協(xié)方差最大，得到潛變量（Latent Variable，LV），潛變量能更好解釋光譜變量中與分類(lèi)相關(guān)的信息，PLS-DA的優(yōu)點(diǎn)是能夠在自變量存在嚴(yán)重多重相關(guān)性的條件下進(jìn)行回歸建模，特別適合處理大量的預(yù)測(cè)因子。通過(guò)對(duì)熒光光譜進(jìn)行PLS-DA分析，可以得到潛變量得分圖（圖6）。根據(jù)PLS-DA算法，潛變量的個(gè)數(shù)理論上與光譜變量數(shù)一樣多，通常建模只選取信息含量較大的頭幾個(gè)潛變量參與建模。由圖6可見(jiàn)三個(gè)潛變量（LV1，LV2，LV3）分別占自熒光光譜的方差信息為96.72%，1.39%，0.63%，總共對(duì)光譜信息的描述達(dá)到了98.74%。采用留一法內(nèi)部交叉驗(yàn)證，對(duì)438個(gè)自熒光光譜建立PLS-DA分類(lèi)模型，得到分類(lèi)結(jié)果如表1所示。從表1中可見(jiàn)，220個(gè)黃龍病樣本，通過(guò)分類(lèi)模型分類(lèi)結(jié)果是185個(gè)黃龍病，35個(gè)健康，真患病率是84%;218個(gè)健康樣本，通過(guò)分類(lèi)模型分類(lèi)結(jié)果是26個(gè)黃龍病和192個(gè)健康，真健康率是88%。我們對(duì)模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一是準(zhǔn)確率，其定義如下：

（6）

結(jié)果表明，基于熒光光譜的PLS-DA模型鑒別準(zhǔn)確率為86.08%。

3.2? 拉曼光譜及建模分析

拉曼光譜體現(xiàn)的是分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)信息，拉曼譜圖用散射光能量隨拉曼位移的變化（即入射頻率與散射頻率之差）表示，通過(guò)峰的位置、強(qiáng)度、形狀等信息，反映被測(cè)物質(zhì)分子的官能團(tuán)或化學(xué)鍵的特征振動(dòng)頻率，提供散射分子的結(jié)構(gòu)信息。如圖7所示，在典型的黃龍病樣本和健康樣本的拉曼光譜數(shù)據(jù)中，均可發(fā)現(xiàn)具有以下拉曼峰且具有一致性：920cm-1（C-C拉伸（脯氨酸環(huán)/葡萄糖/乳酸）），1160cm-1（C-C伸縮/C=C伸縮（蛋白質(zhì)，也包括類(lèi)胡蘿卜素）），1289cm-1（CH2變形（脂質(zhì)）），1331cm-1（多核苷酸鏈（DNA-嘌呤堿基）），1529cm-1（-C=C-（類(lèi)胡蘿卜素））[17]。

健康樣本和黃龍病樣本之間的拉曼譜圖也顯示出顯著的差異，即拉曼峰值強(qiáng)度，拉曼峰值位置和光譜帶寬，特別在920～1100cm-1，1150～1250cm-1，1400～1700cm-1這三個(gè)主要包含碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相關(guān)信息的波數(shù)范圍內(nèi)拉曼光譜變化尤為顯著。黃龍病樣本在1257cm-1，1396cm-1（CH振動(dòng)），1446cm-1（CH2彎曲、拉伸（蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）），1601～1622cm-1（C=C伸縮（酪氨酸和色氨酸））具有更大的拉曼峰值強(qiáng)度和光譜帶寬，但是在1006cm-1（C-C拉伸），1160cm-1（C-C伸縮/C=C伸縮（蛋白質(zhì)，也包括類(lèi)胡蘿卜素）），1191cm-1（類(lèi)胡蘿卜素），1529cm-1（-C=C-（類(lèi)胡蘿卜素））[14，17]，相比健康樣本，黃龍病樣本的拉曼峰值較弱。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)黃龍病影響植物激素的濃度和合成的變化，與碳水化合物代謝相關(guān)的基因的改變導(dǎo)致細(xì)胞中淀粉顆粒的積累，顯癥的葉片中類(lèi)胡蘿卜素的含量相對(duì)較低[18-20]，而類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的特征拉曼峰正是1006cm-1、1160cm-1、1191cm-1和1529cm-1，這與本研究光譜檢測(cè)結(jié)果一致。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，不同組織類(lèi)型中獨(dú)特生物分子相對(duì)于總拉曼活性成分的百分比顯著增加和減少，這些差異的存在表明拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)在柑橘黃龍病快速判別中的具有潛力。通過(guò)對(duì)拉曼光譜進(jìn)行PLS-DA建模分析，可以得到潛變量得分圖（圖8）。由圖8可見(jiàn)前三個(gè)潛變量（LV1，LV2，LV3）分別占拉曼光譜的方差信息為46.63%，13.22%，5.38%，總共對(duì)光譜信息的描述達(dá)到了65.23%。采用留一法內(nèi)部交叉驗(yàn)證，對(duì)438個(gè)拉曼光譜建立PLS-DA分類(lèi)模型，結(jié)果如表2所示。從表2中可見(jiàn)，220個(gè)黃龍病樣本，通過(guò)拉曼光譜分類(lèi)模型分類(lèi)結(jié)果是214個(gè)黃龍病，6個(gè)健康，模型的真患病率是97.27%;218個(gè)健康樣本，通過(guò)拉曼光譜分類(lèi)模型分類(lèi)結(jié)果是2個(gè)黃龍病和216個(gè)健康，模型的真健康率是99.08%，模型總的準(zhǔn)確率為98.17%。

3.3? 拉曼和自熒光混合光譜及建模分析

如前文所述，拉曼光譜和自熒光光譜中都包含有黃龍病和健康樣本中的差異信息。本研究聯(lián)合拉曼和自熒光構(gòu)成的混合光譜進(jìn)行建模分析。基于438個(gè)混合光譜進(jìn)行PLS-DA分析，得到潛變量得分圖（圖9）。由圖9可見(jiàn)這三個(gè)潛變量（LV1，LV2，LV3）分別占混合光譜的方差信息為94.86%，1.55%，0.47%，總共對(duì)光譜信息的描述達(dá)到了96.88%。采用留一法內(nèi)部交叉驗(yàn)證，對(duì)438個(gè)混合光譜建立PLS-DA分類(lèi)模型，結(jié)果如表3所示。從表3中可見(jiàn)，220個(gè)黃龍病樣本，通過(guò)混合光譜分類(lèi)模型分類(lèi)結(jié)果是204個(gè)黃龍病，16個(gè)健康，模型的真患病率是92.73%;218個(gè)健康樣本，通過(guò)拉曼光譜分類(lèi)模型分類(lèi)結(jié)果是9個(gè)黃龍病和209個(gè)健康，模型的真健康率是95.87%，模型總的準(zhǔn)確率為94.75%。對(duì)比表1、表2和表3，基于拉曼光譜的模型鑒別的準(zhǔn)確率最高（98.17%），基于混合模型鑒別的準(zhǔn)確率次之（94.75%），基于自熒光光譜模型的鑒別準(zhǔn)確率最低（86.08%）。究其原因，可能是因?yàn)槔庾V能探測(cè)組織中的分子和生物化學(xué)變化，靈敏度極高，但拉曼光譜的幅度相對(duì)于自熒光而言很小，與自熒光背景混合之后，拉曼光譜中的信息反而被大的熒光背景信息所覆蓋，故而混合光譜的建模準(zhǔn)確率低于拉曼光譜建模的準(zhǔn)確率。

3.4? 三種模型的ROC曲線分析

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)三種模型的分類(lèi)性能，采用分類(lèi)器特性曲線（Receiver Operating Characteristic Curve ，ROC）以及曲線下的面積（Area under curve，AUC）進(jìn)一步評(píng)價(jià)各個(gè)分類(lèi)算法的魯棒性。ROC曲線以真正率為縱坐標(biāo)，假正率為橫坐標(biāo)繪制的曲線，如果二元分類(lèi)器給出的是對(duì)正樣本的一個(gè)分類(lèi)概率，那么通過(guò)設(shè)定不同的閾值，可以得到不同的混淆矩陣，而每個(gè)混淆矩陣都對(duì)應(yīng)于ROC曲線上的一個(gè)點(diǎn)，我們就可以得到一個(gè)經(jīng)過(guò)（0，0），（1，1）的曲線，這就是該分類(lèi)器的ROC曲線。ROC曲線越靠近左上角，試驗(yàn)的準(zhǔn)確性就越高。最靠近左上角的ROC曲線的點(diǎn)是錯(cuò)誤最少的最好閾值點(diǎn)，說(shuō)明模型對(duì)測(cè)試集判斷錯(cuò)誤的總數(shù)最少。ROC曲線與X坐標(biāo)軸所圍成的面積為AUC，這個(gè)面積也可以作為分類(lèi)器的性能評(píng)價(jià)指標(biāo)。其AUC值越大，表征分類(lèi)器的效果越好。對(duì)基于自熒光、拉曼及其混合的模型采用不同的分類(lèi)閾值，畫(huà)出其ROC曲線，如圖10所示。對(duì)應(yīng)于三種模型，ROC曲線的AUC分別為0.9313、0.9991和0.9875，這同樣顯示出使用拉曼光譜構(gòu)建的模型具有更好的判別性能。

4? 結(jié)論

本研究以微區(qū)激光拉曼光譜儀為實(shí)驗(yàn)儀器，以110片健康柑橘葉片和109片黃龍病的柑橘葉片為試驗(yàn)對(duì)象，每個(gè)樣本采集兩個(gè)點(diǎn)，共得到438個(gè)光譜數(shù)據(jù)。通過(guò)多項(xiàng)式擬合分離得到拉曼光譜和自熒光光譜，再結(jié)合PLS-DA分析方法和ROC曲線分析，研究了基于拉曼和自熒光信息的柑橘黃龍病的快速檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，拉曼光譜以及自熒光光譜均可以反映出健康樣本和黃龍病樣本的差異。尤其是拉曼光譜，其譜峰位置都有比較明確的歸屬，健康樣本與黃龍病樣本的差異主要集中在與碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)相關(guān)的位置（920～1100cm-1，1150～1250cm-1和1400～1700cm-1）。

通過(guò)對(duì)自熒光光譜、拉曼光譜以及混合光譜進(jìn)行建模分析，自熒光光譜模型的鑒別準(zhǔn)確率為86.08%，拉曼光譜模型的鑒別準(zhǔn)確率為98.17%，而結(jié)合拉曼光譜與自熒光光譜的混合光譜模型的鑒別準(zhǔn)確率為94.75%，從單一閾值的判斷準(zhǔn)確率對(duì)比，拉曼光譜模型最優(yōu)。進(jìn)一步結(jié)合ROC曲線分析，拉曼光譜模型的ROC曲線下AUC最大，為0.9991，混合光譜的AUC次之為0.9875，熒光光譜模型的AUC最小為0.9313，這進(jìn)一步表明在不同的閾值劃分情況下，拉曼光譜模型的鑒別效果最優(yōu)，表明基于分子水平的拉曼快速無(wú)損檢測(cè)手段在柑橘黃龍病防治工程中具有巨大的潛力。

柑橘黃龍病是一種復(fù)雜的病癥，本研究是以典型的黃龍病樣本和健康樣本進(jìn)行對(duì)比，但對(duì)已經(jīng)染病卻未顯癥的病株能否檢測(cè)，當(dāng)染病病株的病菌分布不均勻，病株體內(nèi)的淀粉顆粒非典型積累其濃度和分布都不均勻時(shí)，如何選取合適光譜采集位置都還需研究，進(jìn)一步可以擴(kuò)大樣本范圍，通過(guò)選取不同染病程度以及未染黃龍病卻因缺素等原因有類(lèi)似癥狀的病株為樣本，通過(guò)多位置的光譜采集比較進(jìn)行探索。

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Rapid detection of citrus Huanglongbing using Raman spectroscopy and Auto-fluorescence spectroscopy

Fen Dai1，2， Zeyuan Qiu1， Qian Qiu1， Chujian Liu1， Guozeng Huang1，

Yalin Huang1， Xiaoling Deng1，2*

（1. College of Electronic Engineering of South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

2. Guangdong Engineering Research Center for Monitoring Agricultural Information， Guangzhou 510642， China）

Abstract： In order to detect citrus Huanglongbing （HLB， also named citrus greening） quickly， Auto-fluorescence and Raman spectra of HLB leaf samples and healthy ones were collected and analyzed. PLS-DA models based on Auto-fluorescence spectra， Raman spectra and mixed spectra were established and compared respectively. Finally， ROC curves of the three models were drawn， and the performance of the models were further evaluated by using the area under curve AUC parameters. The results demonstrated spectral differences between Huanglongbing samples and healthy ones could be seen. With 785 nm laser irradiation， citrus leaf samples produced strong Auto-fluorescence and Raman peaks. The Auto-fluorescence of HLB leaves was weaker than that of healthy samples in the range of 800-1203 cm-1， but stronger in the range of 1206-1800 cm-1， and the slope of decline （absolute value） was smaller than that of healthy samples. The similar shapes were found in the Raman spectra of typical HLB samples and healthy ones. But the HLB samples had larger Raman peak intensity and spectral bandwidth at 1257 cm-1， 1396 cm-1， 1446 cm-1， 1601 cm-1 and 1622 cm-1 than healthy ones. The Raman peak intensity of HLB samples was weaker than that of healthy samples at 1006 cm-1， 1160 cm-1， 1191 cm-1 and 1529 cm-1 positions， suggesting that the carotenoid content of HLB samples was lower than healthy ones. The Auto-fluorescence model， the Raman spectral model and the mixed spectral model could distinguish two kinds of samples with the accuracy of 86.08%， 98.17% and 94.75%， respectively. Furthermore， AUCs of Receiver Operating Characteristic Curve （ROC） were calculated. The AUCs for the Auto-fluorescence model， the Raman spectral model and the mixed spectral model were0.9313、0.9991 and 0.9875， respectively. Through further analysis of ROC curve， the identification effect of the Raman spectral model was optimal. Raman spectroscopy could be a new way to explore the rapid diagnosis of citrus HLB.

Key words： Huanglongbing detection; Raman spectra; Auto-fluorescence spectra; PLS-DA; citrus; diagnose