HPLC法同時(shí)測(cè)定保健食品中10種水溶性維生素

周津 羅格蓮 何文勝

摘 要：本研究采用高效液相色譜法，同時(shí)檢測(cè)保健食品中VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、VB6（吡多胺、吡哆醛、吡哆辛）、泛酸鈣、VB12、VC共10種水溶性維生素。樣品經(jīng)Agilent C18柱（4.6mm×250mm，5μm）分離，使用PDA檢測(cè)器，流動(dòng)相為甲醇與0.025mol/L磷酸二氫鉀溶液（加磷酸調(diào)節(jié)pH=3.1），梯度洗脫。結(jié)果表明，10種水溶性維生素得到良好分離，分離度均大于1.5。10種水溶性維生素線性范圍為0.2～50μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.999 5～1.000 0，平均回收率為92.7%～103.7%，[RSD]為0.37%～2.80%（[n]=3）;10種水溶性維生素的檢測(cè)限為1.5～9.0mg/kg。該方法簡單、方便、快速且準(zhǔn)確，可同時(shí)測(cè)定保健食品中10種水溶性維生素。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;同時(shí)檢測(cè);保健食品;水溶性維生素

中圖分類號(hào)：O657.63;TS218 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-5168（2019）34-0131-04

Simultaneous Determination of 10 Water-soluble Vitamins

in Health Foods by HPLC

ZHOU Jin LUO Gelian HE Wensheng

（Fujian Vocational College of Bioengineering，F(xiàn)uzhou Fujian 350007）

Abstract： In this study， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to detect the contents of VB1， VB2， nicotinic acid， nicotinamide， VB6 （pyridoxamine， pyridoxal， pyridoxine）， calcium pantothenate， VB12 and VC 10 kinds of water-soluble vitamins. The samples were separated on an Agilent C18 column （4.6mm×250mm ， 5 μm） using a PDA detector. The mobile phase was eluted with methanol and 0.025mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （adjusted to pH=3.1 with phosphoric acid）. The results showed that 10 kinds of water-soluble vitamins were well separated， the separation degree was more than 1.5. 10 kinds of water-soluble vitamins linear range of 0.2～50μg/mL， the correlation coefficient of 0.999 5～1.000 0， the recovery rate of 93% to 103%，[RSD] 0.37%～2.80%（[n] = 3）. The detection limits of 10 kinds of water-soluble vitamins were 1.5～9.0mg/kg. The method is simple， convenient， fast and accurate， and can simultaneously measure 10 kinds of water-soluble vitamins in health food.

Keywords： HPLC;simultaneous detection;healthy food;water-soluble vitamin

維生素是一類必須從食物中攝取的有機(jī)化合物，多為酸、醇和酚類物質(zhì)。維生素的種類很多，按溶解性可分為脂溶性維生素（A、D、E、K）和水溶性維生素（B族維生素和VC）。B族維生素有12種以上，被世界一致公認(rèn)的有9種。維生素B族包括維生素B1、維生素B2、維生素B3（煙酸、煙酰胺）、維生素B5（泛酸鈣）、維生素B6（吡哆辛、吡哆醛、吡多胺）、維生素B12（鈷胺素）、維生素B9（葉酸）、維生素B7（生物素）等[1]。

隨著復(fù)合維生素制劑及高檔營養(yǎng)品的出現(xiàn)，同時(shí)檢測(cè)食品藥品中水溶性維生素的含量引起人們的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分析方法多為微生物法、分光光度法，這類方法耗時(shí)、費(fèi)力，已難以滿足當(dāng)前分析要求和發(fā)展趨勢(shì);也有采用HPLC測(cè)定水溶性維生素的方法，但大多限于單一維生素的測(cè)定;僅有《保健食品的高效液相色譜測(cè)定方法》（GB/T 5009.197—2013）同時(shí)測(cè)定保健食品中VB2、VB6、煙酸、煙酰胺等4種水溶性維生素，但該方法使用離子對(duì)試劑、對(duì)色譜柱消耗較大，且儀器難以平衡。目前，也有關(guān)于保健食品中多種水溶性維生素同時(shí)測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道[2-5]，但測(cè)定種類難以覆蓋常見水溶性維生素種類，且尚未有關(guān)于水溶性維生素的提取方法的研究。

因此，研究出能同時(shí)準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)多種水溶性維生素含量的測(cè)定方法具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

儀器：島津LC-20A型高效液相色譜儀，配有SPD-M20A型PDA檢測(cè)器，LCsolution色譜工作站;超聲波清洗器（德國Elma公司P系列）;pH計(jì)（瑞士梅特勒公司SevenCompact系列）;分析天平（瑞士梅特勒公司，感量為0.1mg）;分析天平（瑞士梅特勒公司，感量為0.01mg）;樣品粉碎機(jī)等。

1.2 材料與試劑

主要試劑：甲醇（色譜純）、鹽酸（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）;實(shí)驗(yàn)用超純水由Miliipore純水機(jī)制得，其電阻率不大于18.2MΩ。

標(biāo)準(zhǔn)品：VB1（純度100%）、VB2（純度99.1%）、煙酸（純度99.9%）、煙酰胺（純度99.9%）、泛酸鈣（純度97.5%）、VB12（純度89.7%）、VC（純度100%），以上標(biāo)準(zhǔn)品來自中國食品藥品檢定研究院;吡多胺（純度98.0%）、吡哆醛（純度98.0%）、吡哆辛（純度100.0%），以上標(biāo)準(zhǔn)品來自東京化成。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse C18柱（4.6×250mm，5μm）;流動(dòng)相：A為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.1），B為甲醇;流速：1.0mL/min;柱溫：室溫;進(jìn)樣量：20μL。

檢測(cè)波長：泛酸為210nm;VB1、VC、煙酸、煙酰胺、VB2為260nm;吡哆胺、吡哆辛、吡哆醛均為280nm;VB12為360nm。

1.4 對(duì)照品溶液的配制

1.4.1 各對(duì)照品溶液的制備。精密稱取VB12、煙酸、煙酰胺、泛酸鈣、吡哆胺、吡哆醛、吡哆辛標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，加水溶解配制成濃度為1.0mg/mL的對(duì)照品溶液;準(zhǔn)確稱取VC、VB1標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，用0.01mol/L鹽酸配制成濃度為1.0mg/mL的對(duì)照品溶液;準(zhǔn)確稱取VB2標(biāo)準(zhǔn)品10mg，加水溶解配制成濃度為200μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4.2 混合對(duì)照品溶液的配制。從各對(duì)照品溶液中取1mL溶液（VB2取5mL），加0.01mol/L鹽酸配成濃度為50μg/mL的混合對(duì)照品溶液。按需逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 供試品溶液的制備

1.5.1 維生素片。取適量樣品，用粉碎機(jī)機(jī)將其研成粉末;準(zhǔn)確稱取研制好的樣品0.5g至25mL棕色容量瓶中，加入0.01mol/L鹽酸至近刻度線，超聲20min;待樣液冷卻后定容至刻度即得。

1.5.2 維生素類功能飲料。準(zhǔn)確量取0.5mL至25mL棕色容量瓶中，加入0.01mol/L鹽酸至近刻度線，超聲提取20min;待樣液冷卻后定容至刻度即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

根據(jù)相關(guān)水溶性維生素的理化性質(zhì)[1，6-8]，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，煙酸、煙酰胺、泛酸鈣、吡哆辛、吡哆醛、吡多胺、VB2在純水中溶解良好（VB2加少許稀酸），VB1、VC在0.01mol/L的鹽酸中溶解良好。

2.2 色譜條件

本實(shí)驗(yàn)最初計(jì)劃分離12種水溶性維生素（除本方法中的10種水溶性維生素外，還包括葉酸、生物素），并成功實(shí)現(xiàn)12種水溶性維生素的基線分離（分離度大于1.5，如圖1所示）。然而，葉酸與生物素在優(yōu)化好的儀器條件下重復(fù)測(cè)定，重現(xiàn)性較差，這可能是由于葉酸與生物素在pH=3.1的酸性條件下不穩(wěn)定所致。因此，本方法并不包含葉酸與生物素的測(cè)定。

2.2.1 色譜柱的選擇。本文比較了C8柱與C18柱對(duì)水溶性維生素的分離效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過梯度優(yōu)化后C8柱未能將吡多胺與VB1、葉酸與VB12等物質(zhì)分離開，且VB2未能在較短時(shí)間內(nèi)出峰;而C18柱分離效果良好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇C18柱進(jìn)行分析。

2.2.2 流動(dòng)相pH的選擇。在實(shí)驗(yàn)過程中，將流動(dòng)相pH調(diào)為4和6進(jìn)樣。當(dāng)pH=4時(shí)，色譜圖與pH=3時(shí)較為接近，但分離效果沒有后者好;而當(dāng)流動(dòng)相pH為6時(shí)，部分水溶性維生素難以得到有效分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相pH為3.1。

2.2.3 檢測(cè)波長的選擇。通過PDA檢測(cè)器對(duì)10種水溶性維生素在波長190～400nm進(jìn)行紫外圖譜掃描，綜合各個(gè)維生素的最大吸收波長，選取4個(gè)檢測(cè)通道進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)波長：泛酸為210nm;VB1、VC、煙酸、煙酰胺、VB2為260nm;吡哆胺、吡哆辛、吡哆醛為280nm;VB12為360nm。

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 提取方式。水溶性維生素的提取方法包括直接提取法、超聲提取法[1，6]，尚未有多種水溶性維生素同時(shí)提取的研究報(bào)道。本文以某品牌維生素片劑為試樣，于室溫下用純水提取20min，對(duì)比了靜置提取法、超聲提取法、振蕩提取法等對(duì)8種水溶性維生素的提取效果（由于VB6常以吡哆辛作為有效成分添加，未找到含有吡哆胺、吡哆醛的樣品）。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，對(duì)于VB1、煙酰胺、VB2，超聲提取法的提取率均明顯高于其他兩種方法;對(duì)于其他維生素，超聲提取法提取率與其他兩種方法極為接近。綜上考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇超聲提取法。

2.3.2 提取溶劑。由于水溶性維生素為強(qiáng)極性化合物，文獻(xiàn)報(bào)道多采用純水進(jìn)行提取[2]，也有報(bào)道部分水溶性維生素在酸性條件下提取[3]。本文分別使用純水、鹽酸（0.01mol/L）、流動(dòng)相（磷酸二氫鉀溶液，磷酸調(diào)節(jié)pH=3.1），將上述試樣于室溫下超聲提取20min，考察了不同提取溶劑對(duì)水溶性維生素提取效果的影響。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，鹽酸提取對(duì)煙酰胺、VB6、VB2、煙酸相對(duì)于其他兩種方法提取率明顯較高;而對(duì)于其他維生素，鹽酸提取與其他兩種溶劑提取效果相近（[RSD]<1.3%），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用鹽酸作為提取溶劑。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍。配制濃度為0.2～50μg/mL維生素對(duì)照品混標(biāo)溶液進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，10種水溶性維生素的濃度在0.2～50μg/mL，呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5以上。

2.4.2 精密度。準(zhǔn)確稱取6份樣品，每份樣品約0.5g，按上法操作，測(cè)得各維生素[RSD]在1.11%～4.76%。

2.4.3 加標(biāo)回收率。按上述條件檢測(cè)10種水溶性維生素含量，測(cè)得各維生素平均回收率在92.7%～103.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.11%～2.80%。

2.4.4 檢出限。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，直至信噪比約為3時(shí)的濃度為儀器檢出限，并根據(jù)定容體積25mL，樣品稱樣量0.5g，換算方法檢出限與定量限。結(jié)果表明，10種水溶性維生素的方法檢出限為2～9mg/kg，定量限為5～30mg/kg。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

使用本方法測(cè)定市售保健食品中的水溶性維生素含量，并將測(cè)定結(jié)果與樣品標(biāo)示值及國標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本文所建立的方法可用于保健食品中水溶性維生素的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與參考值基本一致;部分測(cè)定結(jié)果與國標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果有所偏差，仍需進(jìn)行方法對(duì)比等進(jìn)一步研究。

3 討論

本文建立了一種高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定10種水溶性維生素的方法。通過優(yōu)化色譜柱、流動(dòng)相、梯度洗脫條件等，實(shí)現(xiàn)了10種水溶性維生素的基線分離。對(duì)提取方法進(jìn)行了研究，優(yōu)化了提取方式、提取溶劑、提取溫度和提取時(shí)間等。將所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，10種水溶性維生素線性范圍為0.2～50μg/mL，線性系數(shù)為0.999 5～1.000 0;平均回收率在92.7%～103.7%，重復(fù)測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.37%～2.80%（[n]=3）;10種水溶性維生素的檢測(cè)限為1.5～9.0 mg/kg。所建立的方法簡單、方便、快速且準(zhǔn)確，可用于保健食品中多種水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定。

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