鮑曼不動(dòng)桿菌感染的免疫應(yīng)答及免疫療法新進(jìn)展

錢(qián)穎，謝永鵬，石遠(yuǎn)峰，楊娜，劉克喜

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院 連云港市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 連云港 222000)

鮑曼不動(dòng)桿菌(acinetobacter baumannii，AB)是一種廣泛分布于醫(yī)院環(huán)境的革蘭陰性菌，它具有抗干燥、抗氧化應(yīng)激的能力，且難以被普通消毒劑殺滅，憑借頑強(qiáng)的生存能力可以長(zhǎng)期在醫(yī)院環(huán)境中存活[1]。與其他一般細(xì)菌相比，AB的耐藥比例高、耐藥性強(qiáng)，且具有快速獲得耐藥及克隆傳播的特點(diǎn)，其多耐藥、泛耐藥、全耐藥菌株以前所未有的速度在世界流行，給抗感染治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[2]。AB常導(dǎo)致危重患者發(fā)生呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、血流感染，對(duì)于重癥患者AB導(dǎo)致的血流感染的病死率超過(guò)70%[3-4]。AB導(dǎo)致的病死率和醫(yī)療負(fù)擔(dān)在2017年世界衛(wèi)生組織公布的耐藥菌排名中名列榜首[5-6]。AB的超級(jí)耐藥性使感染的治療變得艱難，因此必須尋求其他辦法控制這種機(jī)會(huì)性致病菌引起的感染。細(xì)菌的清除和感染的控制不僅取決于抗生素，也取決于宿主的免疫反應(yīng)，因此有必要了解免疫系統(tǒng)如何應(yīng)對(duì)這種病原菌。固有免疫在抗感染方面發(fā)揮著重要作用，目前關(guān)于AB與免疫系統(tǒng)相互作用的研究主要集中在固有免疫?，F(xiàn)就AB感染的免疫應(yīng)答及免疫療法的新進(jìn)展予以綜述。

1 AB感染的免疫應(yīng)答

1.1固有免疫系統(tǒng)對(duì)AB的識(shí)別 固有免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答，因此免疫細(xì)胞的激活在很大程度上依賴(lài)于模式識(shí)別受體識(shí)別病原體相關(guān)分子的能力。AB的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)、外膜囊泡(outer membrane vesicle，Omv)以及莢膜多糖等抗原成分可被免疫細(xì)胞的多種模式識(shí)別受體識(shí)別[7]。

1.1.1Toll樣受體(toll-like receptors，TLR) TLR是參與AB識(shí)別的最經(jīng)典模式識(shí)別受體，AB的LPS可通過(guò)TLR-4激活巨噬細(xì)胞的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路和促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路，導(dǎo)致大量的炎癥因子釋放，如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-12，隨后導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集，發(fā)揮殺菌作用[8-9]。此外，TLR-9作為一種識(shí)別胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤基序(CpG)DNA的模式識(shí)別受體，可通過(guò)胞內(nèi)定位作用識(shí)別AB的核酸，從而激活NF-κB信號(hào)通路，TLR-9的存在可減少AB的肺內(nèi)定值和限制AB的肺外播散[10]。最近，Marion等[11]證實(shí)，AB的毒力因子Omv作為一種含有多種細(xì)菌成分(LPS、Omp、脂類(lèi)等)的分泌型囊泡也能被TLR-2和TLR-4識(shí)別，其中TLR-4介導(dǎo)的促炎反應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢(shì)。TLR-2也是參與AB識(shí)別的重要組件，但關(guān)于TLR-2的激活是否有利于AB的清除還存在爭(zhēng)議，這可能與用于研究的AB菌株、感染模型、劑量以及刺激途徑等有關(guān)[12]。TLR家族以不同的方式參與眾多毒力因子以及核酸序列的識(shí)別，把控著下游眾多的促炎反應(yīng)，在固有免疫中占據(jù)十分重要的地位，因此通過(guò)干預(yù)這些重要靶點(diǎn)可能對(duì)未來(lái)的免疫調(diào)節(jié)治療具有十分重要的作用。

1.1.2核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR) NLR作為一種胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體也參與AB的識(shí)別。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)1和NOD2可以識(shí)別上皮細(xì)胞吞噬的AB，然后通過(guò)受體相互作用蛋白2介導(dǎo)，啟動(dòng)下游NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生促炎反應(yīng)，當(dāng)該過(guò)程被阻止時(shí)，AB入侵肺上皮細(xì)胞，并且易在肺上皮細(xì)胞增殖和存活[13]。此外，NOD2可通過(guò)促進(jìn)活性氧類(lèi)和活性氮的產(chǎn)生，在肺部感染早期發(fā)揮防御作用，經(jīng)研究證實(shí)，在AB感染前應(yīng)用NOD2配體預(yù)先激活上皮細(xì)胞可以起到保護(hù)作用，可見(jiàn)調(diào)控NOD1及NOD2通路可能是一種有效的控制AB肺部感染的治療策略[14]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體也是參與AB識(shí)別的重要元件，AB感染后可通過(guò)NLRP3-凋亡相關(guān)微粒蛋白-胱天蛋白酶(caspase)1通路促使巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，介導(dǎo)防衛(wèi)[15]。Dikshit等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肺炎模型中泛耐藥AB菌株可通過(guò)NLRP3依賴(lài)的方式促使IL-1β和IL-18表達(dá)，介導(dǎo)免疫防衛(wèi)，但在標(biāo)準(zhǔn)菌株中這種防衛(wèi)作用并未體現(xiàn)。Kang等[15]的研究證實(shí)，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的免疫對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株沒(méi)有防衛(wèi)作用。由此可見(jiàn)，不同AB菌株具有不同的免疫原性，但對(duì)于臨床高度耐藥的AB菌株，NLRP3可能成為其免疫治療的靶點(diǎn)。

1.1.3晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end-product，RAGE) RAGE可以識(shí)別細(xì)菌的LPS，且RAGE作為一種模式識(shí)別受體可以誘導(dǎo)并加劇炎癥反應(yīng)，RAGE-/-小鼠在AB導(dǎo)致的膿毒癥中表現(xiàn)出更小的菌量負(fù)荷和更高的存活率，經(jīng)證實(shí)這與RAGE介導(dǎo)的抗炎因子IL-10表達(dá)受抑制有關(guān)[17]。由此可見(jiàn)，固有免疫細(xì)胞的識(shí)別對(duì)于后續(xù)的免疫殺傷及病原菌清除有重要作用，研究模式識(shí)別受體的作用機(jī)制無(wú)疑為未來(lái)的免疫調(diào)節(jié)治療奠定了基礎(chǔ)，但介于不同的AB菌株存在免疫原性差異，且?guī)缀跛械难芯烤Ａ粲隗w外研究或動(dòng)物體內(nèi)研究階段，因此免疫調(diào)節(jié)作為臨床抗感染的策略還需繼續(xù)深入研究。

1.2上皮細(xì)胞及固有免疫細(xì)胞與AB的相互作用

1.2.1上皮細(xì)胞 上皮細(xì)胞是宿主發(fā)揮免疫防護(hù)作用的第一道防線，作為侵入基體的門(mén)戶(hù)，AB常黏附、定植于呼吸道上皮細(xì)胞表面，這一過(guò)程依賴(lài)于生物膜的形成，與該過(guò)程相關(guān)的AB毒力因子包括OmpA、生物膜相關(guān)蛋白(biofilm associated proteins，Bap)、Bap樣蛋白以及菌毛等，此外，還受到某些基因的調(diào)節(jié)[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，AB分別與人皮膚上皮細(xì)胞和口腔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)均可誘導(dǎo)產(chǎn)生β-防御素2和β-防御素3，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，這兩種防御素對(duì)AB的殺傷作用有一定的濃度依賴(lài)性[19]。同樣，AB也可刺激人氣道上皮細(xì)胞分泌這兩種防御素，發(fā)揮殺菌作用[20]。此外，肺泡上皮細(xì)胞在AB的刺激下可以激活NOD1/NOD2信號(hào)通路，進(jìn)一步發(fā)揮免疫防衛(wèi)作用[14]。由此可見(jiàn)，上皮細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物共同組成了第一道免疫屏障，上皮細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體參與了AB的識(shí)別，進(jìn)而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。

1.2.2中性粒細(xì)胞 AB感染時(shí)可募集多種免疫細(xì)胞，其中占據(jù)中心地位的是中性粒細(xì)胞，它具有強(qiáng)大的吞噬和殺傷能力，與其他固有免疫細(xì)胞相比，中性粒細(xì)胞在對(duì)抗AB感染中貢獻(xiàn)最大[21-23]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體耗竭中性粒細(xì)胞后，感染AB的小鼠發(fā)生嚴(yán)重的肺部感染以及脾臟淋巴組織破壞，而當(dāng)CT8+T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)分別被耗竭后，細(xì)菌的清除力及易感性均未顯著改變[23]。Tsuchiya等[21]采用單克隆抗體分別耗竭中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞后，感染AB的小鼠存活率分別為0、50%和83%。由此可見(jiàn)，相對(duì)其他固有免疫細(xì)胞，中性粒細(xì)胞在AB導(dǎo)致的急性感染中擁有重要地位，因此中性粒細(xì)胞數(shù)量減少或功能降低將直接導(dǎo)致嚴(yán)重感染和不良預(yù)后。中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的胞外誘捕是誘殺和滅活病原微生物的重要武器，AB以及許多其他致病菌可誘導(dǎo)胞外誘捕的形成，但AB與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可以抑制佛波酯誘導(dǎo)的胞外誘捕，進(jìn)而避免被其網(wǎng)羅殺傷[24-25]，Kamoshida等[24]的研究表明，這一機(jī)制可能與AB抑制中性粒細(xì)胞的黏附有關(guān)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AB的苯乙酸代謝途徑受阻導(dǎo)致苯乙酸積累，而苯乙酸可引發(fā)中性粒細(xì)胞聚集，幫助其殺菌[26]，這一發(fā)現(xiàn)為新藥的研發(fā)拓寬了思路?？傊?，中性粒細(xì)胞作為對(duì)抗AB的主力軍，其作用機(jī)制十分復(fù)雜，目前的研究仍處于初步探索階段。

1.2.3巨噬細(xì)胞 雖然巨噬細(xì)胞在AB感染中的免疫作用沒(méi)有中性粒細(xì)胞明顯，但Qiu等[27]發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在防御反應(yīng)早期有較強(qiáng)的吞噬作用，但在感染后期其吞噬作用顯著減弱。Méndez等[28]利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AB可適應(yīng)巨噬細(xì)胞的存在，其中共培養(yǎng)組的AB與單獨(dú)培養(yǎng)組AB相比較共存在97個(gè)差異蛋白，說(shuō)明AB可以通過(guò)自身調(diào)節(jié)適應(yīng)巨噬細(xì)胞的存在，以幫助維持自身的生存。此外，AB還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，它既可以激活骨髓巨噬細(xì)胞caspase-1經(jīng)典焦亡途徑，也可以激活caspase-11非經(jīng)典焦亡途徑，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，進(jìn)而引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[29-30]。Wang等[29]利用小鼠肺炎模型證明了caspase-11的激活對(duì)AB感染小鼠具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用體現(xiàn)在缺乏caspase-11的小鼠清除AB的能力顯著降低，且肺部病變更加嚴(yán)重。而另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，對(duì)于AB誘發(fā)的肺部感染，抗菌肽hLF(human lactoferrin)(1-11)可以抑制依賴(lài)caspase-1活化和IL-1β產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞焦亡，而且可減輕該過(guò)程帶來(lái)的肺部病理?yè)p傷[30]。hLF(1-11)的治療可能得益于抑制細(xì)胞焦亡引發(fā)的過(guò)度炎癥反應(yīng)，可見(jiàn)炎癥反應(yīng)的活化程度是影響預(yù)后的重要因素。最近的研究發(fā)現(xiàn)，AB的Omp34可刺激巨噬細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生活性氧類(lèi)，繼而激活NLRP3，然后繼續(xù)激活下游的caspase家族，引起細(xì)胞焦亡；相反，通過(guò)抑制線粒體產(chǎn)生活性氧類(lèi)，則會(huì)減輕NLRP3過(guò)度活化帶來(lái)的傷害[31]。有個(gè)案報(bào)道，AB感染可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化綜合征，發(fā)病機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化以及免疫失調(diào)導(dǎo)致的炎癥風(fēng)暴有關(guān)[32]?？傊?，不管是巨噬細(xì)胞的活化還是焦亡，它們所引發(fā)的免疫反應(yīng)在抗感染過(guò)程中均具有兩面性，適度的免疫反應(yīng)主要表現(xiàn)為對(duì)病原菌的清除，而過(guò)度的免疫反應(yīng)則會(huì)導(dǎo)致組織損傷，兩者如何平衡是一個(gè)十分復(fù)雜和艱難的問(wèn)題。

1.2.4DC DC作為一種抗原呈遞細(xì)胞，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。AB來(lái)源的Omv可促進(jìn)DC在先天免疫階段產(chǎn)生IL-4等炎癥因子，在適應(yīng)性免疫階段被Omv激活的DC可介導(dǎo)T細(xì)胞分化為輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞)2，導(dǎo)致宿主對(duì)AB產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[33]。DC也可以通過(guò)TLR-4和TLR-2識(shí)別AB的LPS，處理并呈遞給CD4+T細(xì)胞，促使T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化[12]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，DC能夠在AB毒力因子Omp的誘導(dǎo)下啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，同時(shí)，嚴(yán)重的AB感染可導(dǎo)致DC出現(xiàn)功能障礙或死亡，最終限制適應(yīng)性免疫發(fā)揮作用[34]。此外，當(dāng)DC暴露于高濃度的OmpA時(shí)，OmpA可靶向作用于DC的線粒體，誘導(dǎo)活性氧類(lèi)的產(chǎn)生，導(dǎo)致DC死亡[35]?？梢?jiàn)，嚴(yán)重的AB感染可通過(guò)影響DC下調(diào)適應(yīng)性免疫的應(yīng)答作用。中性粒細(xì)胞作為“殺敵”的主力軍固然重要，但也離不開(kāi)DC的幫助。DC可以通過(guò)TLR-4識(shí)別AB，釋放IL-1β，促使CD4+T細(xì)胞分化為效應(yīng)Th17細(xì)胞，而Th17細(xì)胞是一種存在于呼吸道及皮膚等屏障組織中的免疫細(xì)胞，Th17分泌的IL-17具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的能力[36]。這體現(xiàn)了固有免疫的復(fù)雜性，各種免疫細(xì)胞需要互相協(xié)同抵御病原菌，通過(guò)干預(yù)其中某一環(huán)節(jié)可實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。

2 AB感染的免疫療法

近年來(lái)，AB的耐藥性逐漸增加，目前已經(jīng)出現(xiàn)全耐藥型菌株，對(duì)于AB而言，抗生素的黃金時(shí)代可能已經(jīng)過(guò)去，抗感染治療面臨著前所未有的挑戰(zhàn)，而隨著人們對(duì)AB致病機(jī)制了解的加深，接種疫苗(主動(dòng)免疫)和單克隆抗體療法(被動(dòng)免疫)有望成為防治AB感染的新方法。

2.1疫苗 研制針對(duì)性的疫苗防治AB感染是眾多學(xué)者正在努力的方向。目前許多屬于AB的抗原已被了解，Omv、OmpA、Bap、莢膜多糖、自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多聚-N-乙酰葡聚糖等疫苗候選抗原可以顯著改善預(yù)后[37]。Omv和OmpA因具有較高的保守性及良好的免疫原性而得到較多的關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用Omv行主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫均可產(chǎn)生良好的療效，且其免疫血清對(duì)5種臨床型菌株均有效[38]。OmpA是研究較為透徹的毒力因子，是目前較為熱門(mén)的候選疫苗，其主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫均有良好的療效[39-40]。Omv+Bap+OmpA組合形式也可以作為疫苗使小鼠對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床多耐藥菌株產(chǎn)生保護(hù)性免疫，且這種組合形式降低了AB的選擇性壓力，同時(shí)增加了疫苗的有效性[41]。自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種較為保守的表面蛋白，關(guān)于它的研究較少，早期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是一種較為優(yōu)秀的疫苗候選抗原[42]。莢膜多糖具有高度的變異性，目前已發(fā)現(xiàn)存在90余種莢膜多糖血清型，但用莢膜多糖制作的疫苗僅對(duì)部分菌株有效[43]，且莢膜多糖還會(huì)屏蔽OmpA而抑制針對(duì)性抗體的產(chǎn)生，干擾被動(dòng)免疫[44]。而多聚-N-乙酰葡聚糖由于抗原性較弱，不能單獨(dú)作為疫苗抗原。為了給疫苗的研發(fā)尋找更多的可能，有學(xué)者運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和基因組學(xué)技術(shù)篩選出了具有特異性和保守性的AB抗原[28]及基因序列[45-46]。疫苗的出現(xiàn)既可以幫助減少抗生素的接觸，又可以幫助有免疫缺陷或病情危重的患者。盡管這些制劑具有輔助或者替代抗生素的潛力，但目前尚無(wú)針對(duì)AB的疫苗超越Ⅰ期臨床研究階段，其中遇到的困難主要包括抗原序列的變異性以及臨床菌株的復(fù)雜性，因此仍需更深入的探索。

2.2單克隆抗體 單克隆抗體是一種靶向特定抗原的新型抗體，具有高度的專(zhuān)一性且不會(huì)誘導(dǎo)耐藥，針對(duì)特定的病原體靶向制備單克隆抗體也許能夠幫助治療高度耐藥的AB感染。Nielsen等[47]發(fā)現(xiàn)，針對(duì)AB莢膜成分的C8單克隆抗體有治療作用，用純化的C8單克隆抗體治療感染了致死劑量AB的小鼠，結(jié)果小鼠體內(nèi)的細(xì)菌清除率顯著提高，小鼠的存活率也提高，且C8單克隆抗體與黏菌素聯(lián)合治療也表現(xiàn)出很好的協(xié)同作用，相對(duì)單藥治療存活率顯著提高。另外，AB可以通過(guò)形成生物膜避免宿主的殺傷和吞噬，且依賴(lài)生物膜定植于各種植入物表面。TRL1068是一種針對(duì)生物膜中DNABⅡ(deoxyribonucleic acid BⅡ)家族蛋白的單克隆抗體，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，亞胺培南聯(lián)合TRL1086治療多耐藥AB所致的導(dǎo)管相關(guān)皮膚軟組織感染有非常好的療效，與亞胺培南單藥治療相比，聯(lián)合治療組附著在導(dǎo)管處的細(xì)菌顯著減少[48]。但介于許多細(xì)菌均可以形成生物膜，且DNABⅡ表位高度保守，因此預(yù)測(cè)TRL1068具有廣泛的抗生物膜功效，如果可以應(yīng)用于臨床將有益于那些帶有多種植入物的重癥患者。理論上說(shuō)，單克隆抗體是治療疾病的特效藥，但最近的研究首次發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體治療可導(dǎo)致AB感染加重，8E3是針對(duì)K2莢膜多糖的單克隆抗體，但應(yīng)用8E3治療卻導(dǎo)致AB肺部感染小鼠病死率顯著增加，并導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷的大幅增加，原因卻不明[49]。由此可見(jiàn)，單克隆抗體治療AB感染具有一定的復(fù)雜性和風(fēng)險(xiǎn)性，需要進(jìn)一步研究以確定其有效性和安全性。

3 小 結(jié)

上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的模式識(shí)別受體可識(shí)別LPS、Omp、Omv、莢膜多糖等抗原以及核酸序列，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答。中性粒細(xì)胞一旦缺乏將導(dǎo)致極差的預(yù)后，但目前具體作用機(jī)制尚不明確，未來(lái)仍需更深入的探索。疫苗和單克隆抗體的研發(fā)給日漸嚴(yán)峻的抗感染領(lǐng)域帶來(lái)了曙光，但目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，尚不能對(duì)多數(shù)臨床菌株有效。基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正飛速發(fā)展，借助這些新興技術(shù)可能幫助研究者更全面和細(xì)致地了解AB獨(dú)特的基因及蛋白序列，使免疫治療更為精準(zhǔn)有效。