返魂草多糖中免疫增強(qiáng)活性有效組分的篩選及表征

周婷婷 朱迪夫 紀(jì)圣君 王春馳 賈東旭 李艷茹 唐燕

中圖分類號(hào) R932；R392.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0523-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.18

摘 要 目的：篩選并表征返魂草多糖組分中具有免疫增強(qiáng)活性的有效組分。方法：通過水提醇沉法提取返魂草浸膏（SCHE）多糖并制得50%醇沉樣品（SCHE-1）和80%醇沉樣品（SCHE-2）。將小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞分為空白組（不含血清培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（含血清培養(yǎng)基）、脂多糖組（LPS，陽性對(duì)照，1 μg/mL）以及SCHE-1、SCHE-2低、高劑量（0.5、1 mg/mL）組。采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活性，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測RAW264.7細(xì)胞中白介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，以考察SCHE-1和SCHE-2對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫增強(qiáng)活性。采用分子排阻色譜法測定SCHE-1的分子量及其分布；采用高效液相色譜（HPLC）柱前衍生化法測定SCHE-1的單糖組成。采用NaOH法對(duì)SCHE-1進(jìn)行甲基化分析。結(jié)果：與陰性對(duì)照組比較，LPS組及SCHE-1各劑量組均可顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的活性并顯著提高細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平（P<0.01），SCHE-1是具有免疫增強(qiáng)活性的有效組分。SCHE-1含中性糖40.05%、糖醛酸35.62%、蛋白質(zhì)8.89%；SCHE-1為混合物，分子量范圍為62～6 119 Da，單糖組成主要為半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖；SCHE-1的中性糖連接方式以半乳糖的1→3、1→4和1→6連接為主，在1→3連接的O-6位上有分支，非還原末端主要為阿拉伯糖。結(jié)論：SCHE-1可能是返魂草免疫增強(qiáng)活性的有效組分，其主要由多糖類成分組成；SCHE-1可能通過激活巨噬細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。

關(guān)鍵詞 返魂草；多糖；免疫增強(qiáng)活性；篩選；表征

ABSTRACT OBJECTIVE： To screen and characterize effective components of immunopotentiating activity in Senecionis cannabifolii Herba. METHODS： The polysaccharide components were obtained by water extraction and alcohol precipitation method to yield 50% alcohol precipitation sample （SCHE-1） and 80% alcohol precipitation sample （SCHE-2）. The cells from mice mononuclear macrophage line RAW264.7 were divided into blank group （medium without serum）， negative control group （medium with serum）， lipopolysaccharide group （LPS， positive control drug， 1 μg/mL）， SCHE-1 and SCHE-2 low-dose and high-dose groups （0.5， 1 mg/mL）. The cell viability of RAW264.7 cells was detected by MTT assay. The levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α in RAW264.7 were detected by ELISA. These were used to investigate the effects of SCHE-1 and SCHE-2 on the immunological enhancing activity of RAW264.7 cells. The molecular weight and distribution of SCHE-1 were determined by size exclusion chromatography； the monosaccharide composition of SCHE-1 was determined by HPLC pre-column derivatization. Methylation analysis of SCHE-1 was conducted by NaOH method. RESULTS： Compared with negative control group， the activity of RAW264.7 cells was enhanced significantly in SCHE-1 groups and LPS group， which also significantly increased the levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α in cell culture fluids （P<0.01）. SCHE-1 was an effective component with immunopotentiating activity. The neutral sugar content of SCHE-1 was 40.05%， the uronic acid was 35.62%， and the protein was 8.89%. SCHE-1 was a mixture， molecular weight of which was 62-6 119 Da； monosaccharide was mainly composed of galacturonic acid， arabinose （Ara） and galactose （Gal）. The results of methylation analysis showed that the backbone was composed of 1→3， 1→4 and 1→6 linked Gal， and branches were on the O-6 position of the 1→3 linked Gal， and the non-reducing terminals were Ara. CONCLUSIONS： SCHE-1 may be the effective component of immuno potentiating activity， and main component of SCHE-1 is polysaccharide. SCHE-1 may regulate the immune function by activating macrophages to release IL-1β， IL-6 and TNF-α.

KEYWORDS Senecionis cannabifolii Herba； Polysaccharides； Immunopotentiating activity； Screening； Characterization

返魂草（Senecionis cannabifolii Herba，SCH）為我國東北地區(qū)的一種特色藥材資源，其為菊科千里光屬植物返魂草的干燥全草，具有理氣化痰、鎮(zhèn)咳平喘等功效[1]。以返魂草為原料的單方制劑如返魂草顆粒、肺寧口服液等已廣泛用于慢性支氣管炎、肺內(nèi)感染等疾病的治療[2-4]。目前，對(duì)返魂草活性成分的研究主要針對(duì)的是酚酸類和黃酮類成分[5-6]，而對(duì)其多糖組分的研究尚未見報(bào)道。鑒于多糖組分具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，而免疫系統(tǒng)紊亂是機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的主要誘因[7]，因此多糖組分應(yīng)作為返魂草抗炎作用不可缺少的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，對(duì)其進(jìn)行研究具有重要意義。為此，本研究對(duì)返魂草的多糖組分進(jìn)行分離，并篩選及表征其中具有免疫增強(qiáng)活性的有效組分，以期為明確返魂草中的免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；BSA224S-CW型電子分析天平（德國Sartorius公司）；LC-2010型高效液相色譜（HPLC）儀，包括示差折光檢測器、LabSolutions 1.0.0.1凝膠滲透色譜軟件（日本Shimadzu公司）；TSQ8000型氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；GZX-9076MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；NDK200- 2型氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）；TD5A-WS型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；MCO-230AICUVL-PC型CO2培養(yǎng)箱（日本Panasonic公司）；iMark型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

返魂草浸膏（SCHE，吉林益民堂制藥有限公司，批號(hào)：20170709，純度：60.87%）；葡萄糖醛酸對(duì)照品（批號(hào)：K14J759017，純度：98%）、巖藻糖對(duì)照品（批號(hào)：X16N8Y48166，純度：98%）、阿拉伯糖對(duì)照品（批號(hào)：Z29O7H23894，純度：98%）、木糖對(duì)照品（批號(hào)：B02M6W1，純度：98%）、甘露糖對(duì)照品（批號(hào)：C16J8H28561，純度：98%）、半乳糖對(duì)照品（批號(hào)：Z20O7H23186，純度：98%）、半乳糖醛酸對(duì)照品（批號(hào)：S29J8I40844，純度：98%）、葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：S08J6G1，純度：98%）、鼠李糖對(duì)照品（批號(hào)：SJ0715GA13，純度：98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA，中國計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：161205，純度：100%）；葡聚糖（分子量：1 000 Da，批號(hào)：BCBS5664V，純度：98%）、葡聚糖（分子量：5 000 Da，批號(hào)：BCBS8248V，純度：98%）、葡聚糖（分子量：12 000 Da，批號(hào)：BCBR5837V，純度：98%）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，批號(hào)：M30938，純度：99%）、三氟乙酸（TFA，批號(hào)：O47864，純度：99%）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D101大孔吸附樹脂（粒徑：0.3～1.25 mm，滄州寶恩吸附材料科技有限公司，批號(hào)：091011）；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：8117021）、胎牛血清（批號(hào)：1808455）均購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，中國Biosharp公司，批號(hào)：170663）；脂多糖（LPS，批號(hào)：095m4164V，純度：≥99%）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號(hào)：MKBN7264V，純度：98%）均購自美國Sigma公司； 白細(xì)胞介素1β（IL-1β，批號(hào)：180122）、IL-6（批號(hào)：171229）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號(hào)：180122）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖組分提取

取SCHE 200 g，加適量水溶解，經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱，以水洗脫；收集水洗液，加95%乙醇使含醇比例分別至50%和80%進(jìn)行醇沉；以3 000 r/min離心10 min，沉淀加適量水溶解，凍干，分別得50%醇沉樣品（SCHE-1）和80%醇沉樣品（SCHE-2），收率分別為10.14%和7.21%（收率=醇沉樣品質(zhì)量/浸膏質(zhì)量×100%）。

2.2 免疫增強(qiáng)活性組分篩選

2.2.1 MTT法檢測細(xì)胞活性 取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，將其分為空白組、陰性對(duì)照組（含血清培養(yǎng)基）、LPS組（陽性對(duì)照，1 μg/mL）及SCHE-1、SCHE-2低、高劑量組（0.5、1 mg/mL，均以醇沉樣品計(jì)）。各給藥組劑量根據(jù)本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置（下同），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。吸棄各孔上清液，空白組加不含血清DMEM培養(yǎng)基100 μL，陰性對(duì)照組加含血清DMEM培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加含相應(yīng)劑量藥物的DMEM培養(yǎng)基100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加5 mg/mL的MTT溶液（溶劑為pH 7.4的PBS）10 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。棄去上清液，各孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min后，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞活性[細(xì)胞活性=（A給藥組-A空白組）/（A陰性對(duì)照組-A空白組）×100%]。采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同劑量SCHE對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響見表1。

由表1可知，與陰性對(duì)照組比較，LPS組及SCHE-1各劑量組均可顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活性（P<0.01），而SCHE-2各劑量組未表現(xiàn)出明顯影響（P>0.05），提示SCHE-1可能為返魂草免疫增強(qiáng)活性的有效組分。

2.2.2 ELISA法檢測RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于12孔板上，每孔1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，將其分為陰性對(duì)照組、LPS組及SCHE-1、SCHE-2低、高劑量組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別加入培養(yǎng)基、LPS和相應(yīng)濃度的樣品后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，采用相應(yīng)試劑盒測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平。采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同“2.2.1”項(xiàng)下方法。不同劑量SCHE對(duì)RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、Il-6、TNF-α水平的影響見表2。

由表2可知，與陰性對(duì)照組比較，LPS組及SCHE-1低、高劑量組均可顯著提高RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平（P<0.01）；SCHE-2低、高劑量組均可顯著提高TNF-α水平（P<0.01），而對(duì)IL-1β、IL-6水平則無顯著影響（P>0.05），提示SCHE-1是返魂草免疫增強(qiáng)活性的有效組分。

2.3 SCHE-1理化性質(zhì)考察

根據(jù)“2.2”項(xiàng)下研究結(jié)果，SCHE-1是返魂草的免疫增強(qiáng)活性組分，故對(duì)其組成進(jìn)行進(jìn)一步研究。采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為對(duì)照品，采用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度并計(jì)算中性糖含量[8]；采用間羥基聯(lián)苯法，以葡萄糖醛酸為對(duì)照品，采用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度并計(jì)算糖醛酸含量[9]；采用Lowry法，以牛血清白蛋白為對(duì)照品，采用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度并計(jì)算蛋白質(zhì)含量[10]。結(jié)果顯示，SCHE-1含中性糖40.05%、糖醛酸35.62%、蛋白質(zhì)8.89%。因蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)低于中性糖和糖醛酸，故SCHE-1主要由中性糖和糖醛酸組成。

2.4 SCHE-1的分子量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Sepax SRT SEC-100 HPLC凝膠分析柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.7%硫酸鈉溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測器：示差折光檢測器；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別稱取分子量為12 000、 5 000、1 000 Da的葡聚糖和葡萄糖對(duì)照品，加流動(dòng)相溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，制得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。取上述對(duì)照品溶液10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰的保留時(shí)間。以色譜峰的保留時(shí)間（x，min）為橫坐標(biāo)、對(duì)照品分子量的對(duì)數(shù)值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=-0.005 4x3+0.207x2-3.808 0x+24.747 9（r=0.999 9）。

2.4.3 供試品溶液的制備 稱取SCHE-1樣品適量，加流動(dòng)相溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，制得質(zhì)量濃度為5 mg/mL的供試品溶液。

2.4.4 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)。取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄分子量。結(jié)果，重均分子量的RSD為1.01%（n=6），表明儀器精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170715）適量，分別于室溫下放置0、30、60、90、120、150 min時(shí)按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄分子量。結(jié)果，重均分子量的RSD為1.98%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置150 min內(nèi)基本穩(wěn)定。（3）重復(fù)性試驗(yàn)。取SCHE-1樣品適量，共6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄分子量。結(jié)果，重均分子量的RSD為1.51%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 分子量的測定 “按2.4.2”“2.4.3”項(xiàng)下方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并利用GPC軟件計(jì)算其分子量[11]。SCHE-1分子量測定結(jié)果見圖1。由圖1可見，SCHE-1的HPLC圖顯示有多個(gè)峰，提示SCHE-1是由不同分子量物質(zhì)組成的混合物，其分子量范圍為62～6 119 Da，重均分子量為5 864 Da。

2.5 SCHE-1的單糖組成分析

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：pH 6.8的PBS-乙腈（85 ∶ 15，V/V）；流動(dòng)相B：pH 6.8的PBS-乙腈（60 ∶ 40，V/V）；流速：0.9 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖對(duì)照品適量，分別加水溶解制得單一對(duì)照品貯備液。取上述貯備液各5 mL，分別置于螺帽試管中，加0.5 mol/L PMP甲醇溶液6 mL、0.3 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，在70 ℃水浴反應(yīng)1 h；加0.3 mol/L鹽酸溶液5 mL中和，用等體積三氯甲烷萃取3次；取水層，放置過夜，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，得各對(duì)照品的PMP衍生物溶液，濃度為2 mmol/L，作為單一對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 精密稱取SCHE-1樣品20 mg，加2 mol/L TFA于100 ℃水解8 h，衍生化方法同“2.5.2”項(xiàng)下“加0.5 mol/L PMP甲醇溶液6 mL……經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過”，即得供試品的PMP衍生物溶液，作為供試品溶液。

2.5.4 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)。取“2.5.2”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.23%、0.88%、0.73%、1.46%、0.74%、1.11%（n=6），其余3種成分未檢出，表明儀器精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、6、12、18、24、30 h時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖峰面積的RSD分別為0.74%、1.22%、1.77%、0.51%、1.94%、1.36%（n=6），其余3種成分未檢出，表明供試品溶液于室溫下放置30 h內(nèi)基本穩(wěn)定。（3）重復(fù)性試驗(yàn)。取SCHE-1樣品適量，共6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖峰面積的RSD分別為0.99%、1.56%、1.59%、1.98%、1.11%、1.73%（n=6），其余3種成分未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.5 SCHE-1中單糖組分的分析 分別吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰的保留時(shí)間，進(jìn)行SCHE-1單糖組分的分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，SCHE-1是由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其摩爾比為0.171 ∶ 0.099 ∶ 1.000 ∶ 0.218 ∶ 1.166 ∶ 0.920，提示SCHE-1主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成，因SCHE-1組分中含有阿拉伯糖和少量的鼠李糖，說明SCHE-1組分可能主要為果膠類多糖。

2.6 SCHE-1的甲基化分析

2.6.1 GC-MS分析條件 色譜條件：DB-1 MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.33 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?40 ℃，保持7.5 min，以2 ℃/min升至250 ℃，保持20 min；載氣為氮?dú)?，流速? mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為50 ∶ 1。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，噴霧電壓為4 kV，殼氣為60 arb，輔助氣（N2）為10 arb，金屬毛細(xì)管溫度為280 ℃，質(zhì)荷比（m/z）為35～550。

2.6.2 供試品的制備 精密稱取SCHE-1樣品20 mg，置于螺母試管中，加脫水DMSO 0.5 mL，密封攪拌過夜；加NaOH-DMSO混懸液0.4 mL，密封攪拌30 min，再加碘甲烷0.3 mL、水2 mL終止反應(yīng)；加三氯甲烷3 mL萃取，取三氯甲烷層吹干，制得甲基化衍生物，再經(jīng)水解、還原、乙?；?，即得。

2.6.3 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)。取“2.6.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.6.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄阿拉伯糖的保留時(shí)間。結(jié)果，阿拉伯糖保留時(shí)間的RSD為0.67%（n=6），表明方法精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.6.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170715）適量，分別于室溫下放置0、6、12、18、24、30 h時(shí)按“2.6.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄阿拉伯糖的保留時(shí)間。結(jié)果，阿拉伯糖保留時(shí)間的RSD為1.91%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置30 h內(nèi)基本穩(wěn)定。（3）重復(fù)性試驗(yàn)。取SCHE-1樣品適量，共6份，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄阿拉伯糖的保留時(shí)間。結(jié)果，阿拉伯糖保留時(shí)間的RSD為1.44%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.6.4 SCHE-1的甲基化分析 甲基化分析是測定多糖糖鏈各糖殘基連接方式的重要手段之一。其原理是將多糖中的羥基完全甲基化后，經(jīng)水解、還原、乙酰化，再通過GC-MS分析測得部分甲基化糖醇乙酸酯，而未甲基化的位點(diǎn)則為單糖殘基的連接點(diǎn)，由此可推斷多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵類型[12]。SCHE-1的甲基化分析結(jié)果見表3。

由表3可知，SCHE-1的中性糖連接方式以半乳糖的1→3、1→4和1→6連接為主，在1→3連接的O-6位上有分支，非還原末端主要為阿拉伯糖。

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞之一，具有吞噬、抗原提呈以及分泌多種生物活性物質(zhì)的功能。IL-1β、IL-6、TNF-α為巨噬細(xì)胞分泌的幾種主要細(xì)胞因子之一，是巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的重要生物活性蛋白質(zhì)分子[13-14]。通過細(xì)胞活性試驗(yàn)可確定受試樣品能否激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)IL-1β、Il-6、TNF-α的釋放，從而證實(shí)受試樣品具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。本研究通過大孔樹脂將返魂草浸膏進(jìn)行分離得到SCHE-1和SCHE-2組分。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SCHE-1能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，并顯著提高IL-1β、IL-6、TNF-α的水平（P<0.01），表明SCHE-1可能是返魂草免疫增強(qiáng)活性的有效組分，因此對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。

本研究結(jié)果顯示，SCHE-1主要由多糖類成分組成，包括中性糖（40.05%）、糖醛酸（35.62%）；純度和分子量測定結(jié)果表明其為混合物，其分子量為62～6 119 Da，單糖組成主要為半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖；甲基化結(jié)果顯示，SCHE-1的中性糖連接方式以半乳糖的1→3、1→4和1→6連接為主，在1→3連接的O-6位上有分支，非還原末端主要為阿拉伯糖。有研究顯示，多數(shù)植物多糖都具有免疫增強(qiáng)活性，如大棗多糖、竹葉多糖、蟲草多糖等均有提高機(jī)體免疫力的功能[15]。其可通過與免疫細(xì)胞表面的多種受體結(jié)合、激活不同的信號(hào)通路來調(diào)控動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，包括促進(jìn)抗體的分泌、激活補(bǔ)體系統(tǒng)等[16]。SCHE-1可與哪些受體結(jié)合、激活哪些信號(hào)通路從而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用，尚有待相關(guān)研究進(jìn)一步探討。

本研究從返魂草藥材中分離得到了返魂草多糖SCHE-1并對(duì)其進(jìn)行了表征，結(jié)果表明SCHE-1主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖組成，并確定了SCHE-1的分子量及其分布，甲基化結(jié)果明確了糖苷鍵的連接方式。本研究證實(shí)，返魂草多糖SCHE-1是通過激活巨噬細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α來發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，因此推測SCHE-1是返魂草作為抗炎治療藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，但其具體作用機(jī)制還有待后續(xù)研究深入探討。

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（收稿日期：2018-07-06 修回日期：2018-12-06）

（編輯：余慶華）