黃皮種子中香豆素類化合物的分離、鑒定及其α—葡萄糖苷酶抑制活性和全齒復活線蟲致死活性研究

許書慧 陳惠琴 范玉嬌 陳朋偉 梅文莉 戴好富

中圖分類號 R975+.3；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0518-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.17

摘 要 目的：分離、鑒定黃皮種子中香豆素類化合物，并研究其α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齒復活線蟲致死活性。方法：采用柱層析、反相硅膠柱色譜及高效液相色譜技術對黃皮種子的香豆素類化合物進行分離、純化，并根據理化性質和氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）數(shù)據進行結構鑒定。分別以阿卡波糖、阿維菌素為陽性對照，采用對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）法和貝曼漏斗法分別對上述化合物進行體外α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齒復活線蟲致死活性考察。結果：從黃皮種子中共分離鑒定出7個香豆素類化合物，分別為7-羥基香豆素（Ⅰ）、黃皮呋喃香豆精（Ⅱ）、Lansiumarin-C（Ⅲ）、Claucoumarin A（Ⅳ）、Clausenalansimin A（Ⅴ）、（E，E）-8-（7-羥基-3，7-二甲基-2，5-二烯基）補骨脂（Ⅵ）、Dihydroindicolactone（Ⅶ）。在質量濃度為0.25 mg/mL時，化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為（32.4±1.9）%、（37.1±6.0）%、（39.5±1.1）%；在質量濃度為2.5 mg/mL時，化合物Ⅰ、Ⅳ的線蟲校正死亡率分別為50.5%、47.9%。結論：香豆素類化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物Ⅰ、Ⅳ具有全齒復活線蟲致死活性。其中，化合物Ⅲ、Ⅴ的α-葡萄糖苷酶抑制活性、化合物Ⅳ的全齒復活線蟲致死活性均為首次發(fā)現(xiàn)。

關鍵詞 黃皮；種子；香豆素類化合物；分離；鑒定；α-葡萄糖苷酶；全齒復活線蟲

ABSTRACT OBJECTIVE： To isolate and identify the coumarins from the seeds of Clausena lansium， and to study their inhibitory activity of α-glucosidase and nematicidal activity against Panagrellus redivivus. METHODS： Column chromatography， reversed phase silica gel column chromatography and HPLC method were used to separate and purify the coumarins from the seeds of C. lansium. The structures of compounds were identified according to physicochemical properties， 1H-NMR and 13C-NMR spectral data. Using acarbose and avermectin as positive control， PNPG and Berman funnel methods were used to investigate the α-glucosidase inhibitory activity and nematicidal activity against P. redivivus， respectively. RESULTS： Seven coumarins compounds were isolated from the seeds of C. lansium， and were identified as 7-hydroxy-1-benzopiran-2-one （Ⅰ）， Wampetin （Ⅱ）， Lansiumarin-C （Ⅲ）， Claucoumarin A （Ⅳ）， Clausenalansimin A （Ⅴ）， （E，E）-8-（7-hydroxy-3，7-dimethylocta-2，5-dienyloxy） psoralen （Ⅵ）， Dihydroindicolactone （Ⅶ）. Under 0.25 mg/mL， the α-glucosidase inhibitory rates of compounds Ⅰ， Ⅲ， Ⅴ were （32.4±1.9）%，（37.1±6.0）%， （39.5±1.1）%， respectively. Under 2.5 mg/mL， corrected mortality of compounds Ⅰ， Ⅳwere 50.5% and 47.9%. CONCLUSIONS： Compounds Ⅰ， Ⅲ， Ⅴ show α-glucosidase inhibitory activity， and compounds Ⅰ，Ⅳ display nematicidal activity against P. redivivus. α-Glucosidase inhibitory activity of compounds Ⅲ， Ⅴ， and nematicidal activity of compound Ⅳ are found for the first time.

KEYWORDS Clausena lansium； Seeds； Coumarins； Isolation； Identification； α-glucosidase； Panagrellus redivivus

黃皮[Clausena lansium（Lour.） Skeels]為瑞香科（Rutaceae）黃皮屬植物，具有很高的藥用價值，其果實在民間主要用于治療食積脹滿、脘腹疼痛、疝痛、痰飲、咳喘等病癥，葉可用于防治感冒，根則可用于治氣痛[1]；黃皮中含有豐富的生物堿類、香豆素類和揮發(fā)油類化合物，具有保肝解毒、降糖、抑菌、抗腫瘤和促智等生物活性[1-3]。迄今，國內外對黃皮的根、莖、葉等的化學成分研究已有較多報道[4-6]，但對種子部位的研究則相對較少。中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所戴好富研究員課題組前期對黃皮的果皮和種子分別進行研究，發(fā)現(xiàn)黃皮果皮中含有豐富的香豆素類[7]和咔唑類生物堿[8]，而種子中則富含酰胺類生物堿[9-10]，并且種子粗提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齒復活線蟲致死活性。本研究在戴好富研究員課題組前期研究的基礎上對黃皮種子中的化學成分進行研究，并初步探討了其中香豆素類化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齒復活線蟲致死活性，以期為其開發(fā)利用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Avance AV-500型核磁共振波譜儀[瑞士Brucker公司，四甲基硅烷（TMS）為內標]；amaZon SL型離子阱電噴霧質譜儀（德國Bruker公司）；1260型高效液相色譜儀，包括G1311C四元梯度泵、G1329B自動進樣器、Agilent OenLAB工作站、G1316A紫外檢測器（美國Agilent公司）；SUMMIT P680A半制備高效液相色譜儀，包括P680四元梯度泵、7725Ⅰ手動進樣器、Chromeleon工作站、UVP170U紫外檢測器（美國Dionex公司）；ELx800型全自動酶標儀（美國BioTek公司）；SW-40型超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司）；IMF-2型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，批號：N0877）、阿卡波糖（批號：Y0000500）、磷酸鹽粉末（PBS，批號：P3813-10PAK）均購自美國Sigma公司；阿維菌素（北京索萊寶科技有限公司，批號：A9000）；柱層析硅膠（200～300目、60～80目）（青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20、RP-18反相色譜柱填料（德國Merck公司）；D101型大孔吸附樹脂（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；氯仿（氘代試劑，德國Merck公司）；甲醇為色譜純，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亞砜（DMSO）、碳酸氫鈉（Na2CO3）、正丁醇、丙酮、甲醇、氯仿等試劑均為分析純，其余試劑均為工業(yè)重蒸試劑，水為超純水。

1.3 藥材

黃皮果實于2011年5月購自海南省儋州市中國熱帶農業(yè)科學院農貿市場，經中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所王軍博士鑒定為黃皮[Clausena lansium（Lour.） Skeels]，黃皮果實標本（編號：CL20110501）現(xiàn)存放于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所。

2 方法與結果

2.1 黃皮種子中香豆素類化合物的提取與分離

取黃皮種子8.0 kg，曬干粉碎后，于室溫下用95%乙醇浸提3次，每次7 d。所得浸提液過濾后經減壓濃縮得乙醇粗浸膏（500.0 g）；隨后將其分散于水中制成懸濁液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓濃縮得到石油醚萃取物（200.0 g）、乙酸乙酯萃取物（84.6 g）、正丁醇萃取物（120.5 g）和水相（80.0 g）4個部分。

取乙酸乙酯萃取物84.6 g，甲醇重結晶除去大量黃色結晶后，剩余樣品經D101大孔吸附樹脂以甲醇-水（40 ∶ 60～100 ∶ 0，V/V）和丙酮為流動相先后進行洗脫，按每個梯度分段收集，通過薄層色譜（TLC）檢測，合并TLC顯色相同的部分，得到13個流份Fr.1～Fr.13。Fr.5（3.2 g）經RP-18反相色譜柱，以甲醇-水（30 ∶ 70～100 ∶ 0，V/V）為流動相進行梯度洗脫得到10個流份Fr.5.1～Fr.5.10。Fr.5.3經凝膠柱色譜，以甲醇為流動相進行洗脫得到Fr.5.3.4，后經半制備高效液相色譜，以20%乙腈-水（20 ∶ 80，V/V）為流動相，分離得到化合物Ⅰ（1.8 mg）。Fr.5.6經硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（0 ∶ 100～100 ∶ 0，V/V）為流動相進行梯度洗脫得到7個流份Fr.5.6.1～Fr.5.6.7。Fr.5.6.4經凝膠柱色譜，以甲醇為流動相，分離得到化合物Ⅵ（50.8 mg）和流份Fr.5.6.4.4。Fr.5.6.4.4經半制備高效液相色譜，以20%乙腈-水（20 ∶ 80，V/V）為流動相，分離得到化合物Ⅴ（8.3 mg）。Fr.5.6.5反復經硅膠柱色譜分離得到化合物Ⅲ（13.8 mg）。

Fr.6（7.2 g）經RP-18反相色譜柱，以甲醇-水（40 ∶ 60～100 ∶ 0，V/V）為流動相進行梯度洗脫得到8個流份Fr.6.1～Fr.6.8。Fr.6.6經硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（0 ∶ 100～100 ∶ 0，V/V）為流動相進行梯度洗脫得到6個流份Fr.6.6.1～Fr.6.6.6。Fr.6.6.3再次經硅膠柱色譜分離后，經凝膠柱色譜，以甲醇為流動相純化得到化合物Ⅱ（20.5 mg）。Fr.6.6.4經半制備高效液相色譜，以20%乙腈-水（20 ∶ 80，V/V）為流動相，分離得到化合物Ⅳ（1.9 mg）和化合物Ⅶ（1.7 mg）。

2.2 結構鑒定

采用氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）方法對化合物Ⅰ～Ⅶ的結構進行鑒定，其結構式見圖1。

化合物Ⅰ：淡黃色油狀物（甲醇），分子式為C9H6O3，分子量為162.0。電噴霧質譜（ESI-MS）：m/z 161.0[M-H]-。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ： 7.85（1H，d，J=9.4 Hz，H-4），7.46（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.79（1H，dd，J=8.5，2.3 Hz，H-6），6.71（1H，d，J=2.3，H-8），6.18（1H，d，J=9.4 Hz，H-3）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：163.7（C-2），112.3（C-3），146.1（C-4），113.1（C-4a），130.7（C-5），114.6（C-6），163.4（C-7），103.4（C-8），157.3（C-8a）。以上波譜數(shù)據及化合物的理化性質與文獻[11]基本一致，故確定化合物Ⅰ為7-羥基香豆素。

化合物Ⅱ：淡黃色油狀物（甲醇），分子式為C21H18O6，分子量為366.1。ESI-MS：m/z 389.2[M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.77（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.70（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′ ），7.38（1H，s，H-5），6.92（1H，m，H-6″），6.82（1H，d，J=2.2 Hz，H-3′），6.36（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.71（1H，t，J=6.9 Hz，H-2″），5.05（1H，dd，J=12.0，6.9 Hz，H-1″a），5.01（1H，dd，J=12.0，6.9 Hz，H-1″b），4.91（1H，m，H-5″），2.40（1H，dd，J=14.0，7.0 Hz，H-4″a），2.30（1H，dd，J=14.0，7.0 Hz，H-4″b），1.87（3H，s，9″-CH3），1.78（3H，s，10″-CH3）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：160.6（C-2），114.8（C-3），144.5（C-4），116.6（C-4a），113.7（C-5），126.0（C-6），148.7（C-7），131.5（C-8），143.9（C-8a），146.9（C-2′），106.9（C-3′），69.7（C-1″），124.0（C-2″），137.2（C-3″），143.4（C-4″），79.7（C-5″），148.5（C-6″），130.2（C-7″），174.1（C-8″），10.7（C-9″），17.3（C-10″）。以上波譜數(shù)據及化合物的理化性質與文獻[12]基本一致，故確定化合物Ⅱ為黃皮呋喃香豆精。

化合物Ⅲ：黃色油狀物（甲醇），分子式為C21H22O5，分子量為354.1。ESI-MS：m/z 377.2 [M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.76（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.68（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），7.36（1H，s，H-5），6.81（1H，d，J=2.2 Hz，H -3′），6.35（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.62（1H，t，J=7.1 Hz，H-2″），5.02（2H，m，H-1″），4.86（1H，brs，H-8″a），4.80（1H，brs，H-8″b），3.92（1H，t，J=6.4 Hz，H-6″），2.04（2H，m，H-4″），1.68（3H，s，9″-CH3），1.67（3H，s，10″-CH3），1.56（2H，m，H-5″）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：160.7（C-2），114.8（C-3），144.6（C-4），116.6（C-4a），113.5（C-5），126.0（C-6），148.8（C-7），131.6（C-8），144.0（C-8a），146.8（C-2′），106.9（C-3′），70.1（C-1″），120.0（C-2″），142.9（C-3″），32.7（C-4″），35.5（C-5″），75.3（C-6″），111.2（C-7″），147.4（C-8″），17.7（C-9″），16.6（C-10″）。以上波譜數(shù)據及化合物的理化性質與文獻[13]基本一致，故確定化合物Ⅲ為Lansiumarin-C。

化合物Ⅳ：淡黃色油狀物（甲醇），分子式為C21H22O6，分子量為370.1。ESI-MS：m/z 393.2 [M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.78（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.69（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），7.38（1H，s，H-5），6.82（1H，d，J=2.2 Hz，H-3′），6.38（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.70（1H，t，J=6.7 Hz，H-2″），5.29（1H，d，J=7.9 Hz，H-6″），5.03（2H，m，H-1″），4.55（1H，m，H-5″），4.22（1H，d，J=12.6 Hz，H-8″a），4.10（1H，d，J=12.6 Hz，H-8″b），2.29（1H，dd，J=13.4，8.0 Hz，H-4″a），2.20（1H，dd，J=13.4，5.5 Hz，H-4″b），1.81（3H，s，9″-CH3），1.65（3H，s，10″-CH3）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：160.9（C-2），114.9（C-3），144.6（C-4），116.7（C-4a），113.5（C-5），126.1（C-6），148.7（C-7），131.5（C-8），143.7（C-8a），146.7（C-2′），107.0（C-3′），69.9（C-1″），123.3（C-2″），139.7（C-3″），47.9（C-4″），66.0（C-5″），129.7（C-6″），139.2（C-7″），62.3（C-8″），17.3（C-9″），21.8（C-10″）。以上波譜數(shù)據及化合物的理化性質與文獻[14]基本一致，故確定化合物Ⅳ為Claucoumarin A。

化合物Ⅴ：淡黃色油狀物（甲醇），分子式為C21H22O5，分子量為354.2。ESI-MS：m/z 377.2 [M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.76（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.69（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），7.37（1H，s，H-5），6.81（1H，d，J=2.2 Hz，H-3′），6.36（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.69（1H，d，J=7.1 Hz，H-2″），5.11（1H，m，H-6″），5.04（2H，m，H-1″），4.41（1H，td，J=8.4，4.8 Hz，H-5″），2.20（1H，dd，J=13.6，8.5 Hz，H-4″a），2.15（1H，dd，J=13.6，4.7 Hz，H-4″b），1.76（3H，s，9″-CH3），1.68（3H，d，J=1.2 Hz，8″-CH3），1.65（3H，d，J=1.2 Hz，10″-CH3）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：160.6（C-2），114.8（C-3），144.5（C-4），116.6（C-4a），113.6（C-5），126.0（C-6），148.7（C-7），131.5（C-8），144.0（C-8a），146.8（C-2′），106.9（C-3′），69.9（C-1″），123.1（C-2″），139.7（C-3″），48.0（C-4″），66.3（C-5″），127.4（C-6″），135.3（C-7″），17.0（C-8″），25.8（C-9″），18.3（C-10″）。以上波譜數(shù)據及化合物的理化性質與文獻[13]基本一致，故確定化合物Ⅴ為Clausenalansimin A。

化合物Ⅵ：淡黃色油狀物（甲醇），分子式為C21H22O5，分子量為354.2。ESI-MS：m/z 377.3[M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.93（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.82（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），7.46（1H，s，H-5），6.87（1H，d，J=2.2 Hz，H-3′），6.30（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.52（1H，m，H-2″），5.48（1H，d，J=15.6 Hz，H-6″），5.38（1H，dt，J=15.6，6.7 Hz，H-5″），4.93（2H，d，J=7.2 Hz，H-1″），2.61（2H，d，J=6.7 Hz，H-4″），1.57（3H，s，8″-CH3），1.17（6H，s，9″-CH3，10″-CH3）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：162.7（C-2），115.1（C-3），146.7（C-4），117.8（C-4a），114.9（C-5），127.6（C-6），150.0（C-7），132.2（C-8），145.0（C-8a），148.4（C-2′），107.9（C-3′），70.7（C-1″），121.3（C-2″），143.3（C-3″），43.1（C-4″），124.9（C-5″），141.3（C-6″），71.0（C-7″），16.5（C-8″），29.9（C-9″，10″）。以上波譜數(shù)據及化合物的理化性質與文獻[14]基本一致，故確定化合物Ⅵ為（E，E）-8-（7-羥基-3，7-二甲基-2，5-二烯基）補骨脂。

化合物Ⅶ：淡黃色油狀物（甲醇），分子式為C21H20O6，分子量為368.4。ESI-MS：m/z 391.2 [M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.78（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），7.70（1H，d，J=2.1 Hz，H-2′），7.39（1H，s，H-5），6.83（1H，d，J=2.1 Hz，H-3′），6.37（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.69（1H，t，J=6.9 Hz，H-2″），5.06（1H，dd，J=11.9，6.8 Hz，H-1″a），5.01（1H，dd，J=11.9，6.8 Hz，H-1″b），4.58（1H，m，H-5″），2.63（1H，m，H-7″），2.44（1H，dd，J=14.0，6.8 Hz，H-4″a），2.25（1H，dd，J=14.0，6.8 Hz，H-4″b），2.04（1H，ddd，J=13.0，9.8，5.3 Hz，H-6″a），1.87（1H，dt，J=13.0，7.6 Hz，H-6″b），1.75（3H，s，9″-CH3），1.25（3H，d，J=7.3 Hz，10″-CH3）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：160.6（C-2），114.9（C-3），144.5（C-4），116.7（C-4a），113.7（C-5），126.0（C-6），148.8（C-7），131.5（C-8），144.1（C-8a），146.9（C-2′），106.9（C-3′），69.8（C-1″），123.7（C-2″），137.9（C-3″），45.0（C-4″），76.6（C-5″），34.8（C-6″），33.9（C-7″），179.9（C-8″），17.2（C-9″），15.9（C-10″）。以上波譜數(shù)據及化合物的理化性質與文獻[15]基本一致，故確定化合物Ⅶ為Dihydroindicolactone。

2.3 化合物Ⅰ～Ⅶ對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

采用優(yōu)化后的PNPG法[16]進行考察。先配制好PBS溶液（pH 6.8，0.2 mol/L）及待測化合物溶液（取化合物Ⅰ～Ⅶ各1 mg，以DMSO 20 μL溶解；取5 μL該溶液加入PBS 45 μL，混勻即得質量濃度為5 mg/mL的待測化合物溶液）。將以下各溶液在96孔板中混勻：待測化合物溶液10 μL+PBS 70 μL+以PBS為溶劑的2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL（實驗組A）、10%DMSO-PBS溶液10 μL+PBS 70 μL+以PBS為溶劑的2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL（陰性對照B）、5 mg/mL阿卡波糖溶液10 μL+PBS 70 μL + 以PBS為溶劑的2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL（陽性對照）、待測化合物溶液10 μL+PBS 90 μL （背景對照A0）、 10% DMSO-PBS溶液10 μL+PBS 90 μL（空白對照B0）。將96孔板置于37 ℃下溫育15 min，加入2.5 mmol/L PNPG溶液20 μL；繼續(xù)37 ℃下溫育30 min，加入0.2 mol/L Na2CO3終止液80 μL。用酶標儀于405 nm波長處測定并記錄每孔的吸光度，重復3次取平均值，并按以下公式計算酶抑制率：酶抑制率（%）=[（B-B0）-（A-A0）]/（B-B0）×100%[16]（式中，B表示陰性對照的吸光度，B0表示空白對照的吸光度，A表示實驗組的吸光度，A0表示背景對照的吸光度）。結果，在質量濃度為0.25 mg/mL時，化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為（32.4±1.9）%、（37.1±6.0）%、（39.5±1.1）%，陽性對照阿卡波糖的抑制率為（54.2±4.7）%，表明化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其余化合物在相同濃度下的α-葡萄糖苷酶的抑制率均小于10%。

2.4 化合物Ⅰ～Ⅶ對全齒復活線蟲的致死活性考察

參照馬青云等[17]相關文獻進行考察。將全齒復活線蟲接種于燕麥培養(yǎng)基上，于28 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d。按貝曼漏斗法，利用多層擦鏡紙于無菌水中過濾線蟲3次，獲得線蟲懸浮液。取化合物Ⅰ～Ⅶ各1 mg溶于DMSO 20 μL中制成待測化合物溶液。將以下各溶液在96孔板中混勻：待測化合物溶液5 μL（終濃度為2.5 mg/mL）+線蟲懸浮液30 μL（約200～300條線蟲）+無菌水65 μL（實驗組）、DMSO 5 μL+線蟲懸浮液30 μL（約200～300條線蟲）+無菌水65 μL（陰性對照組）、阿維菌素5 μL（終濃度為2.5 mg/mL）+線蟲懸浮液30 μL（約200～300條線蟲）+無菌水65 μL（陽性對照組）。96孔板于室溫條件下培養(yǎng)24 h，在解剖鏡下觀察并統(tǒng)計線蟲死亡數(shù)，統(tǒng)計的線蟲數(shù)量不少于100條，重復3次取平均值，并按以下公式分別計算線蟲死亡率、線蟲校正死亡率：線蟲死亡率（%）=死亡線蟲數(shù)/線蟲總數(shù)×100%[17]；線蟲校正死亡率（%）=[（處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率）/（1-對照線蟲死亡率）]×100%[17]。式中，處理線蟲死亡率是指陽性對照藥和各化合物處理的實驗組；對照線蟲死亡率是指陰性對照組。結果，在質量濃度為2.5 mg/mL時，化合物Ⅰ、Ⅳ的線蟲校正死亡率分別為50.5%、47.9%，陽性對照阿維菌素的線蟲校正死亡率為80.6%，表明化合物Ⅰ、Ⅳ具有全齒復活線蟲致死活性，其他化合物的線蟲校正死亡率均小于10%。

3 討論

黃皮的化學成分主要以香豆素和生物堿為主，戴好富研究員課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃皮果皮中生物堿主要以咔唑類生物堿為主[8]，而種子中以酰胺類生物堿為主[9-10]。本研究從黃皮種子中共分離得到了7個香豆素類化合物，其結構與果皮中發(fā)現(xiàn)的香豆素類化合物較為相似，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ為果皮和種子中均含有的化合物[4]，而化合物Ⅲ、Ⅴ目前只在種子中分離得到。化學成分的異同意味著藥理活性的差異，該發(fā)現(xiàn)為黃皮的綜合合理利用提供了良好的理論基礎。

α-葡萄糖苷酶抑制活性考察結果顯示，化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率為30%以上，略弱于陽性對照藥阿卡波糖。已有藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃皮具有降糖作用，而香豆素類化合物可能與黃皮的降糖作用有關[18-19]，但后續(xù)還需要相關研究深入探討。

全齒復活線蟲致死活性考察結果顯示，化合物Ⅰ、Ⅳ的致死活性在相同濃度下雖弱于陽性對照藥阿維菌素，但線蟲校正死亡率約為50%，仍具有很好的開發(fā)價值。

綜上，本研究從黃皮種子中發(fā)現(xiàn)了7個香豆素類化合物，分別為7-羥基香豆素（Ⅰ）、黃皮呋喃香豆精（Ⅱ）、Lansiumarin-C（Ⅲ）、Claucoumarin A（Ⅳ）、Clausenalansimin A（Ⅴ）、（E，E）-8-（7-羥基-3，7-二甲基-2，5-二烯基）補骨脂（Ⅵ）、Dihydroindicolactone（Ⅶ）?；衔铫瘛ⅱ?、Ⅴ具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物Ⅰ、Ⅳ具有全齒復活線蟲致死活性。其中，化合物Ⅲ、Ⅴ的α-葡萄糖苷酶抑制活性、化合物Ⅳ的全齒復活線蟲致死活性均為首次發(fā)現(xiàn)。

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（收稿日期：2018-09-05 修回日期：2018-12-19）

（編輯：余慶華）