生脈飲多糖提取工藝優(yōu)化及對(duì)脾虛模型大鼠腸道功能調(diào)節(jié)作用的研究

游宇 羅林 陳哲杰 林美斯 許何英 熊波 傅超美 謝恬

中圖分類(lèi)號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0493-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.13

摘 要 目的：優(yōu)化生脈飲多糖的提取工藝，并探討生脈飲及其多糖對(duì)脾虛模型大鼠腸道功能的調(diào)節(jié)作用。方法：采用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量，并計(jì)算多糖提取率；以此為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)生脈飲多糖提取工藝的料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，生脈飲低、中、高劑量組（350、700、1 400 g/L，按生藥量計(jì)）和生脈飲多糖低、中、高劑量組（24.5、49、98 g/L，按生藥量計(jì)），每組10只。除空白組外，其余各組大鼠均灌胃大黃水煎液10 mL/kg復(fù)制脾虛模型，每天1次，連續(xù)15 d。自第16天起，空白組和模型組大鼠均灌胃等容水，其余各組大鼠均灌胃相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)10 d。觀察各組大鼠的一般情況，記錄體質(zhì)量，并采用間苯三酚法或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)其血清D-木糖、胃泌素（GAS）、血管活性腸肽（VIP）含量。結(jié)果：生脈飲多糖最優(yōu)提取工藝為料液比1 ∶ 10（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取溫度80 ℃、提取次數(shù)1次。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，3次提取的多糖提取率分別為7.43%、7.64%、7.80%（RSD=1.01%，n=3）。造模后，除空白組外的其余各組大鼠均出現(xiàn)了大便溏稀、體形消瘦、食量減小等癥狀，且其體質(zhì)量和血清D-木糖含量均較空白組顯著降低（P<0.01）。末次給藥后，各給藥組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善，且除模型組外的其余各組大鼠的體質(zhì)量以及各組大鼠血清D-木糖含量均較同組造模前或給藥前顯著增加（P<0.05或P<0.01）；與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和血清GAS含量均顯著降低，血清VIP含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，生脈飲中劑量組和生脈飲多糖低、高劑量組大鼠體質(zhì)量以及生脈飲中、高劑量組和生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清D-木糖、GAS含量均顯著增加，生脈飲各劑量組和生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清VIP含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：優(yōu)化的生脈飲多糖提取工藝穩(wěn)定、可行。生脈飲及其多糖可有助于恢復(fù)脾虛模型大鼠的腸道功能，這種作用可能與其調(diào)節(jié)腸道GAS、VIP等因子分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞 生脈飲；多糖；多糖提取率；提取工藝；正交試驗(yàn)；脾虛模型；胃泌素；血管活性腸肽；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of Shengmaiyin polysaccharide， and to investigate the regulation effects of Shengmaiyin and its polysaccharide on intestinal function of spleen deficiency model rats. METHODS： The contents of polysaccharide were determined by phenol-sulfuric acid method， and the extraction rate of polysaccharide was calculated. Using extraction rate of Shengmaiyin polysaccharide as investigation index， singel factor and orthogonal tests were used to optimize material-liquid ratio， extraction time， extraction temperature and extraction times of Shengmaiyin polysaccharide. Validation test was also conducted. Totally 80 male SD rats were randomly divided into blank group， model group， Shengmaiyin low-dose， medium-dose and high-dose groups （350， 700， 1 400 g/L， by crude drug）， Shengmaiyin polysaccharide low-dose， medium-dose and high-dose groups （24.5， 49， 98 g/L， by crude drug）， with 10 rats in each group. Except for blank group， other groups were given Rheum palmatum water decoction 10 mL/kg to induce spleen deficiency model， once a day， for consecutive 15 d. Since the 16th day， blank group and model group were given isovolumic water intragastrically， while other groups were given corresponding drugs， once a day， for consecutive 10 d. The general status of rats and body weights were recorded in each group. The serum contents of D-xylose， gastrin （GAS） and vasoactive intestinal peptide （VIP） were detected by phloroglucinol method or ELISA. RESULTS： The optimal extraction technology of Shengmaiyin polysaccharide was material-liquid ratio 1 ∶ 10（g/mL）， extraction time 45 min， extraction temperature 80 ℃， extracting for 1 time. Results of validation test showed that extraction rates of the polysaccharide in 3 times were 7.43%， 7.64%， 7.80% （RSD=1.01%， n=3）. After modeling， except for blank group， other groups suffered from loose stools， thin body and reduced food intake， and the body weight and serum level of D-xylose were decreased significantly compared with blank group （P<0.01）. After last medication， above symptoms of administration groups were improved to different extents. Except for model group， body weight and serum contents of D-xylose in other groups were increased significantly than those before modeling or before medication （P<0.05 or P<0.01）. Compared with blank group， body weight and serum content of GAS were decreased significantly in model group， while serum content of VIP was increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， body weight of Shengmaiyin medium-dose group and Shengmaiyin polysaccharide low-dose and high-dose groups， serum contents of D-xylose and GAS in Shengmaiyin medium-dose and high-dose groups and Shengmaiyin polysaccharide low-dose and medium-dose groups were increased significantly， while serum contents of VIP in Shengmaiyin groups and Shengmaiyin polysaccharide low-dose and medium-dose groups were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The optimized extraction technology of Shengmaiyin polysaccharide is stable and feasible. Shengmaiyin and its polysaccharide contribute to the recovery of intestinal function of spleen deficiency model rat， the effects of which may be associated with the secretion regulation of GAS and VIP.

KEYWORDS Shengmaiyin； Polysaccharide； Extraction rate of polysaccharide； Extraction technology； Orthogonal test； Spleen deficiency model； Gastrin； Vascoactive intestinal peptide； Rats

生脈飲為中醫(yī)經(jīng)典名方，首載于金代張?jiān)氐摹夺t(yī)學(xué)啟源》，云“麥門(mén)冬氣寒，味微苦甘，治肺中伏火，脈氣欲絕。加五味子、人參二味，為生脈飲，補(bǔ)肺中元?dú)獠蛔?，須用之”。該方在中醫(yī)臨床上應(yīng)用歷史悠久，已成為治療心血管疾病的常用方，且其相關(guān)研究也多集中在心血管疾病治療方面[1]。生脈飲組方中人參（為炮制品“紅參”）、麥冬、五味子均含有大量多糖，對(duì)腸道具有一定的調(diào)節(jié)作用，如人參多糖能夠改善氣虛模型大鼠的腸道菌群失調(diào)[2]；麥冬多糖（MDG-1）對(duì)糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠的腸道微生態(tài)平衡均具有一定的調(diào)節(jié)作用[3-5]，同時(shí)還可改善膳食誘導(dǎo)的肥胖模型小鼠的腸道菌群多樣性，促進(jìn)腸道益生菌的繁殖[6]；五味子多糖可改善5-氟尿嘧啶引起的小鼠腸道黏膜炎癥[7]，同時(shí)還可促進(jìn)腸道雙歧桿菌的生長(zhǎng)[8]。然而，目前有關(guān)生脈飲及其多糖對(duì)腸道功能調(diào)節(jié)作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究在優(yōu)化生脈飲多糖提取工藝的基礎(chǔ)上，以脾虛模型大鼠為對(duì)象，考察了生脈飲及其多糖對(duì)脾虛泄瀉致腸道菌群紊亂大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響，并初步探索兩者對(duì)大鼠腸道的調(diào)節(jié)作用，以期為該方的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Varioskan Flash 2.4.3型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；U-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Alleregra X30R型多功能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)[貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司]。

1.2 藥材與試劑

紅參飲片（批號(hào)：1602008）、麥冬飲片（批號(hào)：1604042）、五味子飲片（批號(hào)：1603102）、大黃飲片（批號(hào)：1606080）均購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司；葡萄糖對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-17012905，純度：≥98%）；D-木糖（成都科龍化工試劑廠，批號(hào)：2015080101，規(guī)格：25 g）；D-木糖檢測(cè)試劑盒（間苯三酚法，批號(hào)：20170111）、胃泌素（GAS）試劑盒[酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，批號(hào)：20170113]、血管活性腸肽（VIP）試劑盒（ELISA法，批號(hào)：20170113）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蒽酮、硫酸等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量為200～220 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證書(shū)：SCXK（川）2015-030]。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精確稱(chēng)取干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 按質(zhì)量比1 ∶ 2 ∶ 1的比例稱(chēng)取紅參、麥冬、五味子飲片各適量，混合，以水為溶劑按料液比1 ∶ 8[質(zhì)量（以各藥材質(zhì)量總和計(jì)）體積比，g/mL，下同]提取2次，每次45 min，提取溫度為80 ℃。提取液濾過(guò)后，合并，低溫蒸發(fā)濃縮至原體積的17%，加4倍體積的95%乙醇，于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜后，抽濾，依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌（各2次），經(jīng)冷凍干燥后，即得生脈飲多糖。精密稱(chēng)取上述多糖0.5 g，加水溶解并定容至100 mL量瓶中，濾過(guò)，取濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 空白對(duì)照溶液 以水作為空白對(duì)照溶液。

2.1.4 硫酸-蒽酮溶液 取蒽酮0.1 g，加80%硫酸溶液100 mL，溶解，即得（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

2.2 生脈飲多糖含量測(cè)定方法的建立

采用硫酸苯酚法[9]測(cè)定生脈飲多糖的含量。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL至離心管中，加水至2.0 mL（質(zhì)量濃度為0.021 0～0.094 5 mg/mL），再精密加入新配制的硫酸-蒽酮溶液6 mL，于沸水浴中靜置20 min后，取出，放至冷水中冷卻至室溫，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于625 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸收度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=8.36x-0.042（R2=0.999 3），結(jié)果表明葡萄糖檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.021 0～0.094 5 mg/mL。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液1.2 mL至離心管中，加水至2.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理并重復(fù)測(cè)定其吸收度6次。結(jié)果，葡萄糖吸收度的RSD為1.25%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液1.2 mL，加水至2.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理并于處理后的1、2、3、4、5、6 h時(shí)測(cè)定其吸收度。結(jié)果，葡萄糖吸收度的RSD為1.35%（n=6），表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取各藥材飲片適量，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1.2 mL，加水至2.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定其吸收度并計(jì)算質(zhì)量濃度。結(jié)果，葡萄糖質(zhì)量濃度的RSD為1.83%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下已知質(zhì)量濃度的供試品溶液0.5 mL，共6份，分別加入葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL，加水至2.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定其吸收度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 生脈飲多糖提取率計(jì)算

取生脈飲多糖適量，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定含量后，按如下公式計(jì)算多糖提取率：多糖提取率=c1V1n/m×100%（式中，c1為葡萄糖質(zhì)量濃度，V1為待測(cè)樣品溶液體積，n為稀釋倍數(shù)，m為藥材質(zhì)量）。

2.4 生脈飲多糖提取工藝篩選

2.4.1 單因素試驗(yàn) （1）料液比：按質(zhì)量比1 ∶ 2 ∶ 1的比例精密稱(chēng)取紅參、麥冬、五味子飲片5份，混合，以水為提取溶劑按料液比1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 12提取2次，每次45 min，提取溫度為80 ℃。提取液按“2.1.2”項(xiàng)下方法（從“提取液濾過(guò)后，合并”開(kāi)始操作，下同）處理后，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定多糖含量，再按“2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖1A可知，生脈飲多糖提取率隨著水加入量的增加而升高，當(dāng)料液比為1 ∶ 10后趨于平穩(wěn)，故選擇料液比1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10進(jìn)行后續(xù)考察。（2）提取時(shí)間：按質(zhì)量比1 ∶ 2 ∶ 1的比例精密稱(chēng)取紅參、麥冬、五味子飲片5份，混合，以水為提取溶劑按料液比1 ∶ 8提取2次，每次提取時(shí)間分別為30、45、60、75、90 min，提取溫度為80 ℃。提取液按“（1）”項(xiàng)下處理、測(cè)定并計(jì)算多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1B。由圖1B可知，生脈飲多糖提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間為60 min后趨于平穩(wěn)，故選擇提取時(shí)間30、45、60 min進(jìn)行后續(xù)考察。（3）提取溫度：按質(zhì)量比1 ∶ 2 ∶ 1的比例精密稱(chēng)取紅參、麥冬、五味子飲片5份，混合，以水為提取溶劑按料液比1 ∶ 8提取2次，每次45 min，提取溫度分別為60、70、80、90、100 ℃。提取液按“（1）”項(xiàng)下處理、測(cè)定并計(jì)算多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1C。由圖1C可知，生脈飲多糖提取率隨著溫度的升高先升后降，故選擇提取溫度70、80、90 ℃進(jìn)行后續(xù)考察。（4）提取次數(shù)：按質(zhì)量比1 ∶ 2 ∶ 1的比例精密稱(chēng)取紅參、麥冬、五味子飲片5份，混合，以水為提取溶劑按料液比1 ∶ 8分別提取1、2、3、4、5次，每次45 min，提取溫度為80 ℃。提取液按“（1）”項(xiàng)下處理、測(cè)定并計(jì)算多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1D。由圖1D可知，生脈飲多糖提取率隨著提取次數(shù)的增加而升高，當(dāng)提取次數(shù)為4次后趨于平穩(wěn)，綜合考慮試驗(yàn)效率后，最終選擇提取次數(shù)1、2、3次進(jìn)行后續(xù)考察。

2.4.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)“2.4.1”項(xiàng)下單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、提取次數(shù)（D）這4個(gè)因素進(jìn)行考察，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選多糖提取工藝，其因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表2、表3可見(jiàn)，各因素影響大小依次為C>D>A>B，即提取溫度>提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間。方差分析結(jié)果顯示，提取溫度對(duì)生脈飲多糖的提取具有顯著影響（P<0.05）；其最優(yōu)提取工藝為A3B2C2D1，即料液比1 ∶ 10、提取時(shí)間45 min、提取溫度80 ℃、提取1次。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按質(zhì)量比1 ∶ 2 ∶ 1的比例精密稱(chēng)取紅參、麥冬、五味子飲片各適量，混合，按“2.4.2”項(xiàng)下最優(yōu)工藝平行提取3次，提取液均按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定多糖含量，再按“2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算多糖提取率，結(jié)果分別為7.43%、7.64%、7.80%（RSD=1.01%，n=3），表明該工藝穩(wěn)定、可行。

2.5 生脈飲及生脈飲多糖對(duì)脾虛模型大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響

2.5.1 給藥樣品的制備 （1）生脈飲藥液：按質(zhì)量比1 ∶ 2 ∶ 1的比例精密稱(chēng)取紅參、麥冬、五味子飲片各適量，混合，加入8倍量水，浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并2次提取液，濃縮即得。上述提取物經(jīng)水稀釋后，制得低、中、高劑量（350、700、1 400 g/L，按生藥量計(jì)；劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[10-11]及本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）的生脈飲藥液。（2）生脈飲多糖藥液：按“2.4.2”項(xiàng)下最優(yōu)工藝提取生脈飲多糖，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液溶解，制得低、中、高劑量（24.5、49、98 g/L，按生藥量計(jì)；劑量設(shè)置依據(jù)同“生脈飲”）的生脈飲多糖藥液。（3）大黃水煎液：取大黃飲片適量，第1次加6倍量水，浸泡30 min，80 ℃溫浸提取60 min；第2次加4倍量水，80 ℃溫浸提取45 min；合并2次浸提液，濃縮，得質(zhì)量濃度為2 000 g/L（按生藥量計(jì)；劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[12]）的大黃水煎液。

2.5.2 分組、造模和給藥 將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為8組，即空白組，模型組，生脈飲低、中、高劑量組以及生脈飲多糖低、中、高劑量組，每組10只?？瞻捉M大鼠灌胃水10 mL/kg，其余各組大鼠均灌胃大黃水煎液10 mL/kg以復(fù)制大鼠脾虛模型，每天1次，連續(xù)15 d。自第16天起，空白組和模型組大鼠均灌胃水10 mL/kg，其余各組大鼠均灌胃相應(yīng)藥液10 mL/kg，每天1次，連續(xù)10 d。

2.5.3 一般狀況 觀察各組大鼠的皮毛、大便排泄情況以及活動(dòng)狀態(tài)，并分別于造模前、造模后（給藥前）及末次給藥后稱(chēng)定其體質(zhì)量。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果顯示，造模前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后（給藥前），除空白組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)大便溏稀、體形消瘦、食量減小、皮毛枯槁、精神萎靡、蜷縮、拱背以及不同程度的脫肛。造模后（給藥前），空白組大鼠的體質(zhì)量較同組造模前顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與空白組比較，其余各組大鼠的體質(zhì)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。末次給藥后，各給藥組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善，空白組、生脈飲各劑量組及生脈飲多糖各劑量組大鼠的體質(zhì)量均較同組造模前顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與空白組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，生脈飲中劑量組及生脈飲多糖低、高劑量組大鼠體質(zhì)量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)表5。

2.5.4 血清D-木糖含量 測(cè)定各組大鼠造模后（給藥前）及末次給藥后血清中D-木糖的含量。所有大鼠均禁食、不禁水12 h后，自眼眶取血0.5 mL至1.5 mL EP管中；隨后每只大鼠灌胃10%D-木糖溶液10 mL/kg，1 h后再自眼眶取血0.5 mL于另一1.5 mL EP管內(nèi)。血液樣品靜置1 h后，以3 500 r/min離心10 min，分離血清，采用間苯三酚法以紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于554 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值，并計(jì)算大鼠血清中D-木糖含量[血清D-木糖含量=（測(cè)定OD值-測(cè)定空白OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-試劑空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（式中，“測(cè)定OD值”為各組大鼠灌胃D-木糖溶液后血漿樣品的OD值，“標(biāo)準(zhǔn)OD值”為檢測(cè)試劑盒中1.33 mmol/L D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的OD值，“測(cè)定空白OD值”為各組大鼠灌胃D-木糖溶液前血漿樣品的OD值，“試劑空白OD值”為測(cè)定試劑即間苯三酚的OD值，“標(biāo)準(zhǔn)品濃度”為檢測(cè)試劑盒中D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度）]，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同“2.5.3”項(xiàng)。

結(jié)果顯示，造模后（給藥前），模型組及各給藥組大鼠血清D-木糖含量均顯著低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。末次給藥后，各組大鼠血清D-木糖含量均較給藥前顯著升高，且生脈飲中、高劑量組以及生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清D-木糖含量均顯著高于同期模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)表6。

2.5.5 血清GAS、VIP含量 末次給藥后，所有大鼠均禁食、不禁水12 h，自眼眶分別取血0.5 mL置于1.5 mL EP管內(nèi)，靜置1 h后，以3 500 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA法以全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)血清中GAS和VIP含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同“2.5.3”項(xiàng)。

結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清GAS含量顯著降低，VIP含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，生脈飲中、高劑量組以及生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清GAS含量均顯著升高，生脈飲各劑量組以及生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清VIP含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)表6。

3 討論

生脈飲出自《醫(yī)學(xué)啟源》，方中人參甘溫，可益元?dú)狻⒀a(bǔ)肺氣、生津液，是為君藥；麥冬甘寒，可養(yǎng)陰清熱、潤(rùn)肺生津，是為臣藥；二者合用，則益氣養(yǎng)陰之功益彰。五味子酸溫，可斂肺止汗、生津止渴，是為佐藥。三藥共奏，一補(bǔ)一潤(rùn)一斂，以達(dá)益氣養(yǎng)陰、生津止渴之功。生脈飲方中人參、麥冬、五味子均含有大量多糖，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道菌群失調(diào)有一定的改善作用[2-8]。為此，本研究在優(yōu)化生脈飲多糖提取工藝的基礎(chǔ)上，初步探討了生脈飲及其多糖對(duì)脾虛模型大鼠體質(zhì)量和相關(guān)指標(biāo)的影響。

中藥的多糖提取率受提取方法、提取次數(shù)、提取溫度、料液比等因素的影響較大[13-16]，需經(jīng)過(guò)相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化來(lái)確定多糖的最優(yōu)提取工藝。本研究通過(guò)單因素考察確定了各影響因素的參數(shù)范圍，再結(jié)合經(jīng)典的正交試驗(yàn)法、以多糖提取率為考察指標(biāo)對(duì)生脈飲多糖提取工藝進(jìn)行了篩選優(yōu)化。結(jié)果顯示，料液比1 ∶ 10（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取溫度80 ℃、提取1次為生脈飲多糖提取的最優(yōu)工藝，且驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)上述工藝穩(wěn)定、可行。

中醫(yī)認(rèn)為“脾主運(yùn)化”，其功能主要與小腸吸收、胃腸激素分泌等密切相關(guān)，脾失健運(yùn)可導(dǎo)致腹脹、泄瀉等腸道功能紊亂癥狀；同時(shí)，泄瀉還可導(dǎo)致腸道蠕動(dòng)加快、排便次數(shù)增加，最終造成腸道菌群的紊亂。大黃瀉下致大鼠脾虛模型可致其腸道雙歧桿菌、乳酸菌等厭氧菌數(shù)量顯著減少，是公認(rèn)的脾虛模型經(jīng)典建立方法之一[17-20]，故本研究選擇該方法建立大鼠脾虛模型。已有研究證實(shí)，生脈飲組方中的各藥味均可不同程度地改善脾虛模型大鼠的腸道功能[2-7]，且本研究旨在初步考察生脈飲全方及其多糖對(duì)脾虛模型大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響，故暫未設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組。

脾虛泄瀉可導(dǎo)致大鼠腸道功能受損，使其體質(zhì)量明顯下降，故大鼠體質(zhì)量的高低可間接反映其腸道功能正常與否。本研究結(jié)果顯示，造模后（給藥前），除空白組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)大便溏稀、體形消瘦、食量減少等癥狀，且其體質(zhì)量均較空白組顯著降低。末次給藥后，除模型組外，其余各組大鼠的體質(zhì)量均顯著增加，且生脈飲中劑量組及生脈飲多糖低、高劑量組大鼠體質(zhì)量均較模型組顯著升高。這提示生脈飲及其多糖可不同程度地緩解脾虛模型大鼠大便溏稀等癥狀，并有助于增加其體質(zhì)量、恢復(fù)其腸道功能。

D-木糖是一種戊糖，口服后經(jīng)小腸吸收，在體內(nèi)不被肝臟代謝，直接經(jīng)腎臟排出。正常情況下，D-木糖在血液中是幾乎不存在的，因此在灌服一定劑量的D-木糖溶液后測(cè)定血清中D-木糖含量，可用以間接評(píng)價(jià)腸黏膜的吸收功能[12]。本研究結(jié)果顯示，造模后（給藥前），模型組及各給藥組大鼠血清D-木糖含量均顯著低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；末次給藥后，各組大鼠血清D-木糖含量均較給藥前顯著升高，且生脈飲中、高劑量組以及生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清D-木糖含量均顯著高于同期模型組。這提示生脈飲及其多糖可促進(jìn)D-木糖的小腸吸收，可能與其恢復(fù)腸道黏膜功能有關(guān)[7]。

GAS是一種很重要的胃腸道激素，主要是由胃竇G細(xì)胞分泌，具有調(diào)節(jié)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等生理活性，是衡量胃腸道生理功能的重要指標(biāo)[21]，其含量的降低提示消化道功能處于低下或紊亂狀態(tài)[21-22]。VIP是腸道主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，其可抑制胃酸的分泌，是胃腸道疾病研究的重要指標(biāo)[23]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清GAS含量顯著降低，VIP含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，生脈飲中、高劑量組以及生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清GAS含量均顯著升高，生脈飲各劑量組以及生脈飲多糖低、中劑量組大鼠血清VIP含量均顯著降低。這提示生脈飲及其多糖對(duì)脾虛模型大鼠腸道的改善作用可能與調(diào)節(jié)腸道GAS、VIP含量有關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，與模型組比較，末次給藥后生脈飲高劑量組以及生脈飲多糖中劑量組大鼠體質(zhì)量雖有所增加，但組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與空白組亦無(wú)顯著差異，筆者推測(cè)可能與大鼠個(gè)體差異有關(guān)。此外，生脈飲多糖高劑量組大鼠血清D-木糖（末次給藥后）、GAS和VIP含量與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，筆者推測(cè)可能與劑量設(shè)置范圍有關(guān)，具體量效關(guān)系還有待后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究以多糖提取率為指標(biāo)，確定了生脈飲多糖的最優(yōu)提取工藝，即料液比1 ∶ 10（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取溫度80 ℃、提取1次。生脈飲及其多糖可有助于恢復(fù)脾虛模型大鼠的腸道功能，這種作用可能與其調(diào)節(jié)腸道GAS、VIP等因子分泌有關(guān)。但本研究并未考察兩者對(duì)腸道菌群的影響，也未深入挖掘其具體作用機(jī)制和量效關(guān)系，故有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。

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（收稿日期：2018-06-24 修回日期：2018-12-04）

（編輯：張?jiān)拢?/p>