基于Wnt/β—catenin信號通路的三七/白及膠海綿促進(jìn)糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制研究

雷霆 孫東旭 周軍 魏海梁 張習(xí)祿 陳志國

中圖分類號 R269；R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0483-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.11

摘 要 目的：研究三七/白及膠海綿促進(jìn)糖尿病足潰瘍（DFU）模型大鼠創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。方法：取健康SD大鼠，采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)、一次性腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，再以釹鐵硼磁鐵壓軋大鼠背部制作潰瘍創(chuàng)面造成DFU模型。將60只DFU模型大鼠隨機(jī)分為A組（空白組，即生理鹽水紗布組）、B組（凡士林紗布組）、C組（明膠海綿組）、D組（三七/白及膠海綿組），每組15只。各組大鼠分別給予相應(yīng)紗布/敷料覆蓋創(chuàng)面進(jìn)行干預(yù)治療，每1～2天換藥1次。干預(yù)治療后第3、7天時，分別肉眼觀察各組大鼠創(chuàng)面愈合情況并計(jì)算創(chuàng)面愈合率；采集創(chuàng)緣組織制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法測定創(chuàng)面組織中β-連環(huán)素（β-catenin）、糖原合成激酶-3β（GSK-3β）、R-脊椎蛋白3（Rspo3）的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：干預(yù)治療后第3、7天時，與A、B、C組分別比較，D組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P<0.05）；創(chuàng)面組織的炎細(xì)胞浸潤、膠原纖維沉積、毛細(xì)血管和肉芽組織生長均明顯增加；β-catenin、Rspo3的mRNA表達(dá)水平均有升高，GSK-3β的mRNA表達(dá)水平均有降低，且除了干預(yù)治療后第3天時的β-catenin和第7天時的GSK-3β與C組比較差異不顯著外，其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：三七/白及膠海綿可有效促進(jìn)DFU模型大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合；其作用機(jī)制可能與Wnt/β-catenin 通路中β-catenin、Rspo3的mRNA表達(dá)的上調(diào)和GSK-3β的mRNA表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 三七/白及膠海綿；糖尿病足潰瘍；創(chuàng)面；促愈合；Wnt/β-catenin通路；機(jī)制；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of wound healing promotion of Panax notoginseng-Bletilla striata gum sponge on diabetic foot ulcer （DFU） model rats. METHODS： Healthy SD rats were selected and given high-lipid and high-glucose diet， intraperitoneal injection of streptozotocin once to establish diabetes model. Neodymium-iron-boron magnet was used to press the back of rats to make ulcer wound then established DFU model. Totally 60 DFU model rats were randomly divided into group A（blank group， i.e. normal saline gauze group）， group B（vaseline gauze group），group C （gelatin sponge group） and group D （P. notoginseng-B. striata gum sponge group）， with 15 rats in each group. The rats were given corresponding gauze/sponge to cover the wound for intervention treatment， changing dressing once every 1-2 days. On the 3rd and 7th day after intervention， the wound healing of rats in each group was observed with naked eyes， and the wound healing rate was calculated. The wound margin tissue was collected to obtain HE staining section， and histopathological observation was conducted under microscope. mRNA expression of β-catenin， GSK-3β and Rspo3 in wound tissue were determined by RT-PCR. RESULTS： On the 3rd and 7th day after intervention， compared with group A， B， C， healing rate of group D was increased significantly （P<0.05）； inflammatory cell infiltration， collagen deposition， capillary and granulation tissue growth in wound tissue increased significantly. The mRNA expression levels of β-catenin and Rspo3 all increased， and those of GSK-3β all decreased； except for the difference of β-catenin at the 3rd day and GSK-3β at the 7th day after intervention between group D and group C were not significant， the difference of other indicators was statistically significant （P<0.05）. CONCLUSIONS： P. notoginseng-B. striata gum sponge can effectively promote the wound healing in DFU model rats， the mechanism of which may be associated with up-regulating the expression of β-catenin and Rspo3 mRNA and down-regulating the expression of GSK-3β mRNA.

KEYWORDS Panax notoginseng-Bletilla striata gum sponge； Diabetic foot ulcer； Wound； Healing promotion； Wnt/β-catenin pathway； Mechanism； Rat

糖尿病足潰瘍（Diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有12%～25%的糖尿病患者可能在病程中出現(xiàn)足部潰瘍，而因DFU導(dǎo)致的截肢率約比普通患者高出14倍，嚴(yán)重時可引發(fā)膿毒血癥導(dǎo)致患者死亡[1]。DFU診療的關(guān)鍵在于及早給予干預(yù)治療、避免病情惡化，而在糖尿病早期促進(jìn)DFU創(chuàng)面修復(fù)是目前臨床上亟待解決的難題。

祖國醫(yī)學(xué)采用生肌止血類藥物治療創(chuàng)面愈合性疾病的歷史久遠(yuǎn)、療效獨(dú)特。《瘡瘍科綱要》中指出：“瘡瘍?yōu)椴?，發(fā)見于外，外治藥尤為重要”[2]。臨病辨證運(yùn)用中藥外敷于DFU，可使藥物直接作用于創(chuàng)面，在其周圍形成平衡濕潤的環(huán)境，可改善潰瘍局部的血液循環(huán)，增加局部血供，加快機(jī)體代謝，促進(jìn)肉芽組織生長和肌纖維組織增生，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。我院自制制劑三七/白及膠海綿是一種新型的創(chuàng)面敷料，在前期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，該敷料能夠促進(jìn)早期DFU創(chuàng)面血管增生、使局部組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)水平升高[3]，但其具體作用機(jī)制和治療靶點(diǎn)尚不明確。已有研究證實(shí)，Wnt/β-連環(huán)素（β-catenin）信號通路在 DFU 的肉芽組織增生階段起關(guān)鍵作用[4]。因此，本課題組通過觀察 Wnt 信號通路中β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、R-脊椎蛋白3（Rspo3）調(diào)控基因的表達(dá)來探討三七/白及膠海綿治療DFU的作用機(jī)制，為該敷料用于臨床提供更可靠的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BSA822型電子天平[賽多利斯（中國）有限公司]；DF-101型實(shí)驗(yàn)室恒溫磁力加熱攪拌器（鞏義市科瑞儀器有限公司）；穩(wěn)豪型血糖測試儀（強(qiáng)生中國醫(yī)療器械有限公司）；CM1950型冷凍切片機(jī)（德國LEICA公司）；R104型快速勻漿器（德國IKA公司）；QQMK-10型干式恒溫器（上海啟前電子科技有限公司）；qTOWER 2.2型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）儀（德國JENA公司）；-80 ℃低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；釹鐵硼磁鐵（上海健茨商貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

明膠、白及膠、三七粉、甘油、戊二醇、25%戊二醇溶液（本院藥劑科提供）；明膠海綿、凡士林紗布、生理鹽水紗布（本院設(shè)備科提供）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；TRNzol總RNA提取試劑、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑[天根生化科技（北京）有限公司] ；0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（西安市索歐實(shí)驗(yàn)器材銷售公司）；本實(shí)驗(yàn)用水符合三級水標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動物

健康SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2012-002。動物在陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心清潔級動物房進(jìn)行飼養(yǎng)；標(biāo)準(zhǔn)飼料由河南天馳實(shí)驗(yàn)動物飼料有限公司提供，高糖高脂飼料由西安灝洋生物技術(shù)有限公司提供。

2 方法

2.1 三七/白及膠海綿的制備

取明膠3 g溶于裝有100 mL純水的燒杯中，在50 ℃水浴條件下使其充分溶解；加入白及膠1 g，置于磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌，使白及膠在明膠溶液中溶解混勻；再依次加入三七粉1 g、甘油（保濕劑）3 mL、25%戊二醛溶液（交聯(lián)劑）4 mL，繼續(xù)攪拌混勻。將溶液倒入金屬凍干圓盤（直徑20 cm，高4 cm），放置待冷卻，以保鮮膜覆蓋，置于-20 ℃冰箱中預(yù)凍24～36 h后放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍（≥48 h）。冷凍完畢后取出，裁剪成1.0 cm×1.0 cm大小，密封包裝，以鈷60射線輻照滅菌消毒即得。

2.2 分組、造模和干預(yù)治療

2.2.1 大鼠DFU模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，自第2周開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取10只大鼠作為空白組；其余70只大鼠作為模型組，建立DFU模型?？瞻捉M大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。每周稱量各組大鼠體質(zhì)量，并于大鼠尾靜脈采血檢測大鼠隨機(jī)血糖。第5周起，除空白組大鼠一次性腹腔注射等體積0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液外，其余組大鼠一次性腹腔注射1%STZ溶液（30 mg/kg，以0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制）以建立糖尿病模型。注射STZ溶液后第3、7、14、21天時，稱量大鼠體質(zhì)量并檢測隨機(jī)血糖。當(dāng)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L則認(rèn)為糖尿病模型建立成功[5]（自此開始，模型組大鼠換用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)；同時為防止大鼠死亡，當(dāng)血糖≥25 mmol/L時給予適量胰島素控制血糖）。取成功建立糖尿病模型的大鼠以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，制作潰瘍創(chuàng)面：采用釹鐵硼磁鐵在大鼠背部左右兩側(cè)壓出直徑為1 cm的圓形全層皮膚組織缺失，可深至筋膜層，達(dá)到實(shí)驗(yàn)動物創(chuàng)面潰瘍的慢性損傷程度[5]即為DFU模型成功建立。

2.2.2 DFU模型大鼠的創(chuàng)面干預(yù)治療 取DFU模型大鼠60只，隨機(jī)分為A組（空白組，即生理鹽水紗布組）、B組（凡士林紗布組）、C組（明膠海綿組）、D組（三七/白及膠海綿組），每組15只。各組大鼠先分別以相應(yīng)紗布/敷料覆蓋創(chuàng)面后，再在上面覆蓋無菌紗布，然后最外層以繃帶包扎，每1～2天換藥一次。干預(yù)治療后，大鼠單籠飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好、環(huán)境溫度和濕度適宜，每日明暗交替各12 h；給予純凈水、普通飼料喂養(yǎng)。密切觀察大鼠有無撕咬紗布/敷料等情況，并及時處理。

2.3 大鼠創(chuàng)面愈合情況及組織病理學(xué)觀察

干預(yù)治療后第3、7天時，肉眼觀察各組大鼠的創(chuàng)面愈合情況，包括創(chuàng)面色澤、滲出、組織水腫程度等情況。然后將帶有網(wǎng)格的透明膜貼在大鼠創(chuàng)面處，采用掃描儀掃描并以Adobe Photoshop CS6 軟件測算創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率[愈合率=（DFU造模時創(chuàng)面面積-干預(yù)治療后第n天創(chuàng)面面積）/DFU造模時創(chuàng)面面積×100%]。同時，每組取5只大鼠，采集創(chuàng)緣組織，在4%多聚甲醛溶液中固定后，制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，然后在顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織中炎細(xì)胞、毛細(xì)血管和肉芽組織等情況。

2.4 大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β、Rspo3的mRNA表達(dá)水平檢測

干預(yù)治療后第3、7天時，每組取5只大鼠，采集創(chuàng)面邊緣組織，迅速用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，放入無菌無酶的EP管中，置入冰盒并于-80 ℃條件下保存待測。采用RT-PCR法檢測。首先按照試劑（盒）說明書步驟提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列見表1）。擴(kuò)增條件（反應(yīng)體系為25 μL）：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸32 s，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳、染色、成像。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 造模過程中大鼠體質(zhì)量和血糖水平變化

注射STZ前，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長速度略快；注射STZ后，空白組大鼠體質(zhì)量仍穩(wěn)步增長，而模型組大鼠體質(zhì)量未見明顯增長甚至有所下降。注射STZ前，與空白組比較，模型組大鼠的隨機(jī)血糖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；注射STZ后，與空白組比較，模型組大鼠隨機(jī)血糖水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模過程中大鼠體質(zhì)量變化見表2，血糖水平變化見表3（注：由于模型組大鼠在造模過程中時有死亡，因此數(shù)量有不同程度的減少）。

3.2 各組DFU模型大鼠的創(chuàng)面愈合率

干預(yù)治療后第3、7天時，與A組（空白組）比較，其余各組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著升高；與B組比較，C組和D組大鼠的創(chuàng)面愈合率均顯著升高；與C組比較，D組大鼠的創(chuàng)面愈合率顯著升高，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組DFU模型大鼠的創(chuàng)面愈合率見表4。

3.3 各組DFU模型大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化

干預(yù)治療后第3天，A組（空白組）大鼠創(chuàng)面組織有少量炎細(xì)胞，新生毛細(xì)血管最少；B組大鼠創(chuàng)面組織有少量炎細(xì)胞浸潤，新生毛細(xì)血管很少；C組大鼠創(chuàng)面組織炎細(xì)胞浸潤較多，有較少量新生毛細(xì)血管；D組大鼠創(chuàng)面組織炎細(xì)胞浸潤較多，有少量新生毛細(xì)血管及肉芽組織生長。干預(yù)治療后第7天，A組（空白組）大鼠創(chuàng)面組織可見炎細(xì)胞浸潤，有少量新生毛細(xì)血管和少量膠原纖維；B組大鼠創(chuàng)面組織新生毛細(xì)血管數(shù)量稍顯增加，可見炎細(xì)胞浸潤及少量膠原纖維；C組大鼠創(chuàng)面組織可見少量炎細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管數(shù)量增加，有較多膠原纖維沉積；D組大鼠創(chuàng)面組織的炎細(xì)胞較少，有大量膠原纖維沉積，肉芽組織增多，新生毛細(xì)血管數(shù)量明顯增加。各組DFU模型大鼠組織病理學(xué)顯微圖見圖1。

3.4 各組DFU模型大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β、Rspo3的mRNA表達(dá)水平

干預(yù)治療后第3、7天時，與A組（空白組）比較，其余各組大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、Rspo3的mRNA表達(dá)水平均有升高，GSK-3β的mRNA表達(dá)水平均有降低，除干預(yù)治療后第3天時B組的GSK-3β外，其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與B組比較，C組和D組大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、Rspo3的mRNA表達(dá)水平均有升高，GSK-3β的mRNA表達(dá)水平均有降低，除干預(yù)治療后第3天時C組的GSK-3β外，其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與C組比較，D組大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、Rspo3的mRNA表達(dá)水平均有升高，GSK-3β的mRNA表達(dá)水平均有降低，除干預(yù)治療后第3天時的β-catenin和第7天時的GSK-3β外，其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組DFU模型大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、Rspo3、GSK-3β的mRNA表達(dá)水平見圖2～圖4。

4 討論

慢性潰瘍創(chuàng)面愈合是多因素共同作用的結(jié)果，新生血管作為肉芽組織重要的組成部分，為創(chuàng)面的愈合提供血氧供應(yīng)，因此血管生成的多少及快慢能影響DFU創(chuàng)面愈合[6]。傳統(tǒng)中醫(yī)同樣也認(rèn)為“創(chuàng)面難愈”關(guān)鍵在于肉芽生長期的氣虛血瘀。只有氣血足、局部瘀滯祛除，才能斷生腐之源、生長皮，故臨床治療常以“祛瘀生新”為治法。結(jié)合“祛瘀生肌”經(jīng)典理論[7]，本課題組選取止血生肌類白及/三七藥對研制出三七/白及膠海綿用于DFU創(chuàng)面愈合治療。近5年來臨床實(shí)踐證明該中藥敷料療效顯著，但因其作用機(jī)制尚不明確，故限制了其臨床轉(zhuǎn)化和推廣。

經(jīng)典Wnt /β-catenin通路被認(rèn)為具有促進(jìn)創(chuàng)面血管新生及上皮重塑等多方面的功能，在創(chuàng)面修復(fù)早期的肉芽組織增生階段可能起到關(guān)鍵作用[7]。而DFU創(chuàng)面組織中呈現(xiàn)出的纖維母細(xì)胞、毛細(xì)血管減少等特點(diǎn)，也與β-catenin編碼基因表達(dá)水平降低[8]相一致。DFU創(chuàng)面組織中GSK-3β表達(dá)水平升高，這與其作為 Wnt 信號通路負(fù)性調(diào)控因子的生理作用是相符的[9]。Rspo3蛋白作為 Wnt 信號通路的激活因子，在DFU創(chuàng)面組織中呈現(xiàn)低表達(dá)[9-10]。因此，Wnt/β-catenin 信號通路可能在DFU的肉芽組織增生階段起關(guān)鍵作用，這為治療DFU提供了新的治療靶點(diǎn)。

筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚無基于Wnt 信號通路的中藥敷料促進(jìn)DFU創(chuàng)面愈合作用的機(jī)制研究。因此本課題組首先在動物造模時，通過實(shí)時動態(tài)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量和血糖水平的變化，以確保在5周時間內(nèi)成功建立大鼠DFU模型；同時，在干預(yù)治療階段對模型大鼠通過飲食、胰島素進(jìn)行血糖控制，為其創(chuàng)面愈合打好生理基礎(chǔ)。隨機(jī)分組給予生理鹽水紗布、凡士林紗布、明膠海綿、三七/白及膠海綿進(jìn)行干預(yù)治療。在干預(yù)治療第3、7天時進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示給予三七/白及膠海綿干預(yù)治療的DFU模型大鼠創(chuàng)面愈合率高，肉芽組織生成及毛細(xì)血管數(shù)量增加、膠原纖維沉積表達(dá)明顯增多；Wnt信號通路中β-catenin、Rspo3 mRNA 表達(dá)水平較其余各組均顯著升高，負(fù)調(diào)控因子GSK-3β的mRNA 表達(dá)水平較其余各組均顯著降低。

綜上，三七/白及膠海綿可促進(jìn)DFU模型大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織生長、血管增生和膠原纖維沉積，加快慢性潰瘍創(chuàng)面愈合；其作用機(jī)制可能與Wnt/β-catenin 通路中β-catenin、Rspo3的mRNA表達(dá)上調(diào)和GSK-3β的mRNA表達(dá)下調(diào)相關(guān)。三七/白及膠海綿是否還可能通過其他途徑對Wnt/β-catenin 信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，又或者對其他因子進(jìn)行交叉調(diào)節(jié)來促進(jìn)DFU的愈合，還需要進(jìn)一步研究論證。

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（收稿日期：2018-06-26 修回日期：2019-01-01）

（編輯：段思怡）