茯苓甘草湯對功能性消化不良模型大鼠的改善作用機(jī)制研究

曹峰 劉楊 秦源 鄭子安 葛玉紅 唐阿梅

中圖分類號 R289.3；R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0473-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.09

摘 要 目的：研究茯苓甘草湯對功能性消化不良（FD）模型大鼠的改善作用機(jī)制。方法：取SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、茯苓甘草湯高劑量組（20 g/kg）、茯苓甘草湯低劑量組（10 g/kg）、聯(lián)用組（茯苓甘草湯10 g/kg+多潘立酮0.004 g/kg）、多潘立酮組（0.004 g/kg），每組10只。除正常組外，其余組大鼠均灌胃冰稀鹽酸建立FD模型。造模結(jié)束后，正常組和模型組大鼠灌胃等體積常溫蒸餾水，其余組大鼠灌胃相應(yīng)常溫藥物溶液（1 mL/100 g），每天1次，連續(xù)7 d。測定大鼠胃內(nèi)殘?jiān)恳栽u價(jià)胃排空功能。采用免疫組化SP法檢測胃黏膜組織中水通道蛋白3（AQP3）、胃促生長素（Ghrelin）、P物質(zhì)（Substance P）的蛋白表達(dá)水平；采用蛋白印跡法檢測胃黏膜組織中緊密連接蛋白1（Claudin-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、血管活性腸肽（VIP）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠胃內(nèi)殘?jiān)棵黠@增多（P<0.01）；胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達(dá)明顯減少，Substance P蛋白陽性表達(dá)較多；AQP3、Ghrelin、Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)水平顯著降低，Substance P、VIP蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠胃內(nèi)殘?jiān)棵黠@減少（P<0.05或P<0.01）；各給藥組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達(dá)較多，Substance P蛋白陽性表達(dá)較少；各給藥組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Occludin蛋白表達(dá)水平顯著升高，VIP蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）；茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組和聯(lián)用組大鼠胃黏膜組織中Ghrelin、Claudin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，Substance P蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：茯苓甘草湯可能通過對大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)的上調(diào)和Substance P、VIP蛋白表達(dá)的下調(diào)，從而改善FD模型大鼠水液潴留癥狀。

關(guān)鍵詞 茯苓甘草湯；功能性消化不良；水通道蛋白3；胃促生長素；P物質(zhì)；緊密連接蛋白1；閉鎖蛋白；血管活性腸肽；腦腸軸；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study improvement effects of Fuling gancao decoction on functional dyspepsia （FD） model rats. METHODS： Sixty SD rats were randomly divided into normal group， model group， Fuling gancao decoction high-dose group （20 g/kg）， Fuling gancao decoction low-dose group （10 g/kg）， drug combination group （Fuling gancao decoction 10 g/kg+domperidone 0.004 g/kg）， domperidone group （0.004 g/kg）， with 10 rats in each group. Except for normal group， other groups were givenicy dilute hydrochloric acid intragastrically to establish FD model. After modeling， normal group and model group were given constant volume of distilled water at room temperature intragastrically， and other groups were given relevant drug solution （1 mL/100 g） intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. The amount of gastric residue was measured to evaluate the gastric emptying function. Immunohistochemistry SP method was used to detect the protein expression of AQP3， Ghrelin and Substance P in gastric mucosa tissue. The protein expression of Claudin-1， Occludin and VIP were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with normal group， the amount of gastric residue was increased significantly in model group （P<0.01）； positive expression of AQP3 and Ghrelin protein in gastric mucosa tissue was decreased significantly， while the positive expression of Substance P protein tended to increase； the protein expression levels of AQP3， Ghrelin， Claudin-1 and Occludin were decreased significantly， while those of Substance P and VIP were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the amount of gastric residue was decreased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）； the positive expression of AQP3 and Ghrelin protein tended to increase， while less positive expression of Substance P was found； the protein expression levels of AQP3 and Occludin in gastric mucosa tissue were increased significantly in administration groups， while those of VIP were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the protein expression levels of Ghrelin and Claudin-1 in gastric mucosa tissue were increased significantly in Fuling gancao decoction high-dose group， Fuling gancao decoction low-dose group and drug combination group， while those of Substance P were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Fuling gancao decoction may improve the symptom of fluid retention in FD model rats by up-regulating the protein expression of AQP3， Ghrelin， Claudin-1 and Occludin and down-regulating the protein expression of Substance P and VIP in gastric mucosa tissue of rats.

KEYWORDS Fuling gancao decoction； Functional dyspepsia； AQP3； Ghrelin； Substance P； Claudin-1； Occludin； Vasoactive intestinal peptide； Brain-gut axis； Rat

功能性消化不良（Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是無明顯胃器質(zhì)性病變并以上腹部疼痛或不適、飽脹、噯氣不舒、嘔逆等為臨床癥狀的消化系統(tǒng)疾病；其在臨床上常表現(xiàn)為胃排空延遲，部分表現(xiàn)為胃液體排空延遲[1]。FD的癥狀表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)的胃虛飲停證的范疇。作為治療胃虛飲停證的代表方劑茯苓甘草湯，我國中醫(yī)經(jīng)典《傷寒論》中記載其具有溫胃化飲的功效，主治心下悸、胃中痞滿、胃中有振水聲等。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，茯苓甘草湯能顯著促進(jìn)FD模型大鼠胃中液體排空，其作用可能與提高胃底乙酰膽堿酯酶（AChE）含量、降低胃底一氧化氮（NO）含量的機(jī)制有關(guān)[2]。已有研究證實(shí)，F(xiàn)D的發(fā)生過程中常伴有胃黏膜組織中多種蛋白的異常表達(dá)[3-4]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過考察茯苓甘草湯干預(yù)治療FD模型大鼠后對其胃黏膜組織中水通道蛋白3（AQP3）、胃促生長素（Ghrelin）、P物質(zhì)（Substance P）、緊密連接蛋白1（Claudin-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、血管活性腸肽（VIP）蛋白表達(dá)的影響，探討茯苓甘草湯治療FD的作用機(jī)制，以期為該方劑的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

FA124型電子分析天平（上海邦西儀器科技有限公司）；KD-202A型石蠟切片機(jī)（浙江科迪儀器設(shè)備有限公司）；CX21型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；PowerPAC Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

多潘立酮片（西安楊森制藥有限公司，批號：170306533，規(guī)格：10 mg）；AQP3、Ghrelin、Substance P、Claudin-1、Occludin、VIP和β-肌動蛋白（β-actin）抗體（一抗，英國Abcam公司，批號分別為ab125219、ab209790、ab216414、ab15098、ab216327、ab8556、ab8227）；山羊抗兔辣根過氧化酶抗體（二抗）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.2～7.4）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為109525、ZLI-9062）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯影劑（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號分別為G1120、PC0020、PE0010、G1120、DA1010）；MinuteTM 動物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒[英文特生物（北京）技術(shù)有限公司，貨號：SD-001/SN-002]；水為自制蒸餾水（pH7.2～7.4）。

1.3 藥材

茯苓、桂枝、甘草（炙）、生姜均購自貴州同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院董麗莎教授鑒定為正品。茯苓甘草湯按《傷寒論》原方比例配伍：茯苓30 g、桂枝30 g、炙甘草15 g、生姜45 g。取按此比例配伍好的藥材100 g，分次加水1 000、800、800 mL煎煮3次，每次40 min；濾過，合并3次濾液，于60 ℃緩慢蒸發(fā)至每毫升藥液相當(dāng)于原藥材1 g（動物實(shí)驗(yàn)時(shí)給藥劑量以原藥材量計(jì)），在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動物

SD清潔級大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0011]，由貴陽中醫(yī)學(xué)院SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[動物飼養(yǎng)許可證號：SYXK（黔）2012-0001]。室溫設(shè)為（20±2）℃，動物固體顆粒飼料由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

取大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、茯苓甘草湯高劑量組（20 g/kg）、茯苓甘草湯低劑量組（10 g/kg）、聯(lián)用組（茯苓甘草湯10 g/kg+多潘立酮0.004 g/kg）、多潘立酮組（0.004 g/kg），每組10只。正常組大鼠灌胃常溫蒸餾水0.8 mL，其余各組大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[2]灌胃溫度為0 ℃、濃度為0.5 mol/L的稀鹽酸0.8 mL建立大鼠FD模型。連續(xù)灌胃14 d后，正常組和模型組大鼠灌胃等體積常溫蒸餾水，其余各組大鼠灌胃常溫相應(yīng)濃度的藥物溶液1 mL/100 g（藥品/藥液均以蒸餾水稀釋至適當(dāng)濃度），每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 大鼠胃排空功能檢查

末次給藥前，各組大鼠先禁食8 h，然后給予半流質(zhì)飼料（固體顆粒飼料搗碎后加水調(diào)配）和碳粉混合物（2 g/只），10 min后再給予蒸餾水或相應(yīng)藥物。給藥30 min后，處死大鼠，取胃組織在洗凈前后分別稱定質(zhì)量，并計(jì)算胃內(nèi)殘?jiān)浚ㄎ竷?nèi)殘?jiān)?胃總質(zhì)量-胃凈質(zhì)量），以評價(jià)大鼠胃排空功能。

2.3 大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P的蛋白表達(dá)水平檢測

采用免疫組化SP法檢測。取“2.2”項(xiàng)下各組5只大鼠的胃組織，放入4%多聚甲醛中固定后，以自來水沖洗4 h，再以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（由低到高）分別脫水1 h；二甲苯透明20 min×2次；液體石蠟中浸蠟1.5 h×2次，包埋，切片（厚度為6 μm）；以常規(guī)二甲苯脫蠟15 min×2次，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（由高到低）分別水化；PBS浸泡5 min，3%過氧化氫封閉10 min；PBS沖洗后分別滴加AQP3、Ghrelin、Substance P抗體（1 ∶ 100），4 ℃孵育12 h后滴加二抗（1 ∶ 300）；DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明并封片鏡檢。于顯微鏡下觀察胃黏膜組織中目的蛋白表達(dá)情況，陽性表達(dá)呈棕黃色。每組各蛋白隨機(jī)選擇5張切片，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析光密度值以表示蛋白表達(dá)水平。

2.4 大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin、VIP蛋白表達(dá)水平檢測

采用蛋白印跡法檢測。取“2.2”項(xiàng)下各組5只大鼠的胃組織，-80 ℃條件下低溫保存。檢測時(shí)取50 mg胃黏膜組織，按照MinuteTM動物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒說明書方法進(jìn)行總蛋白提取后，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，取蛋白50μg上樣，濃縮膠80 V電泳1 h，分離膠130 V電泳1 h。根據(jù)目的蛋白分子量切膠后，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h；分別加入Claudin-1、Occludin、VIP蛋白抗體（1 ∶ 3 000）和β-actin抗體（1 ∶ 8 000），4 ℃孵育24 h；TBST緩沖液沖洗3次，加入二抗（1 ∶ 7 000），常溫孵育2 h；TBST緩沖液沖洗3次，ECL發(fā)光液顯影。以β-actin為參比，采用Ima- ge Pro Plus 6.0軟件分析目的蛋白條帶相對灰度值，以表示蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 茯苓甘草湯對大鼠胃排空功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃內(nèi)殘?jiān)棵黠@增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃內(nèi)殘?jiān)棵黠@減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表1。

3.2 茯苓甘草湯對大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P蛋白表達(dá)的影響

正常組大鼠黏膜組織腺泡內(nèi)AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達(dá)較多，其中Ghrelin蛋白在黏膜至黏膜下層都有明顯表達(dá)；Substance P蛋白陽性表達(dá)較少。模型組大鼠黏膜組織腺泡內(nèi)AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達(dá)明顯減少，其中AQP3蛋白表達(dá)從黏膜至黏膜下層逐步減少；Substance P蛋白陽性表達(dá)較多，在黏膜至黏膜下層表達(dá)明顯。茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組、聯(lián)用組和多潘立酮組大鼠黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達(dá)較多，與正常組相似；Substance P蛋白陽性表達(dá)較模型組明顯減少。各組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P蛋白表達(dá)的組織切片顯微圖見圖1～圖3。

定量分析結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Substance P蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠胃黏膜組織中AQP3蛋白表達(dá)水平顯著升高；茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組和聯(lián)用組大鼠胃黏膜組織中Ghrelin蛋白表達(dá)水平顯著升高，Substance P蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表2。

3.3 茯苓甘草湯對大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin、VIP蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)水平均顯著降低，VIP蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組和聯(lián)用組大鼠胃黏膜組織中Claudin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高；各給藥組大鼠胃黏膜組織中Occludin蛋白表達(dá)水平顯著升高，VIP蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或 P<0.01）。各組大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin、VIP蛋白表達(dá)電泳圖見圖4，蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表3。

4 討論

隨著社會快速發(fā)展、人們工作和生活壓力的不斷增加，F(xiàn)D的發(fā)病率逐年增加，而胃和小腸排空異常是導(dǎo)致FD發(fā)生的主要病理生理機(jī)制之一[5-6]。其發(fā)病原因常與腦腸軸失衡、慢性炎癥、內(nèi)臟感覺異常、幽門螺旋桿菌感染、精神壓力及飲食失調(diào)等密切相關(guān)，發(fā)病過程較為復(fù)雜[7]。AQP3蛋白作為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛分布于胃腸道上皮細(xì)胞層內(nèi)，對水分轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用[8]。Occludin、Claudin-1蛋白屬于緊密連接家族蛋白成員，在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間作為骨架蛋白起連接作用，是胃腸黏膜屏障功能和生理結(jié)構(gòu)完整性的重要保護(hù)蛋白，對維持水分子、細(xì)胞大分子等物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞旁通透有重要意義，兩者的異常表達(dá)會造成胃腸黏膜緊密連接功能異常和組織滲透壓失衡[9-10]。Ghrelin蛋白是一種生長激素促分泌素受體的配體蛋白，作為垂體-下丘腦-胃腸道的媒介蛋白，其主要分布在胃腸道，在胃組織中含量最高，參與能量代謝、胃腸消化蠕動、內(nèi)分泌等過程，具有促進(jìn)攝食的作用[11-12]。VIP蛋白為舒血管腸肽，屬于神經(jīng)腦腸肽，在消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多個(gè)組織均有分布，主要分布在黏膜內(nèi)分泌細(xì)胞和黏膜下神經(jīng)叢和肌層，它能調(diào)節(jié)平滑肌和腺體分泌，對胃腸動力有抑制性調(diào)節(jié)作用[13-14]。Substance P蛋白作為雙向調(diào)節(jié)蛋白，在介導(dǎo)疼痛和炎癥浸潤等過程中有重要作用，與受體結(jié)合能引起血管舒張和通透性增高，參與組織損傷，同時(shí)又可刺激胃腸蠕動等[15]。

本研究選擇多潘立酮作為陽性對照藥物，其為多巴胺受體拮抗劑，臨床常用來治療FD。該藥可通過拮抗多巴胺受體，擴(kuò)張食管括約肌，改善幽門收縮，增強(qiáng)腸胃動力，促進(jìn)腸胃蠕動，加快腸胃排空[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)冰稀鹽酸造模模擬胃虛飲停證的大鼠出現(xiàn)FD現(xiàn)象，而給予茯苓甘草湯后能明顯減少大鼠胃內(nèi)殘?jiān)?，表明該湯劑具有促胃腸運(yùn)動作用，可改善因消化不良造成的胃內(nèi)潴留。將不同劑量的茯苓甘草湯單用或者與多潘立酮聯(lián)用，可使AQP3蛋白表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)水液代謝、減少胃內(nèi)水液潴留；可使Ghrelin、Claudin-1、Occludin等連接蛋白表達(dá)水平升高，從而減輕水液潴留所致腹脹、胃動力低下的癥狀；可使Substance P、VIP蛋白表達(dá)水平降低，從而減輕胃腸蠕動抑制，減少血管因擴(kuò)張導(dǎo)致的通透性增加，減輕水液積聚。而單獨(dú)使用多潘立酮后，也同樣對上述蛋白表現(xiàn)出相似的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，茯苓甘草湯可能通過對大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)的上調(diào)和Substance P、VIP蛋白表達(dá)的下調(diào)，從而改善FD模型大鼠水液潴留癥狀。

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（收稿日期：2018-09-09 修回日期：2019-01-01）

（編輯：段思怡）