晶型對落新婦苷納米混懸劑體內(nèi)外行為的影響

汪小涵 王聰穎 劉肖 沈成英 鐘芮娜 申寶德 袁海龍

中圖分類號 R283.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0458-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.06

摘 要 目的：探討晶型對落新婦苷納米混懸劑（AT-NS）體內(nèi)外行為的影響。方法：分別采用沉淀法和微型化介質(zhì)研磨法制備兩種AT-NS，即AT-NS1和AT-NS2，采用納米激光粒度儀測定其粒徑和多分散性指數(shù)（PDI）；通過X射線衍射技術(shù)（XRD）、電鏡掃描技術(shù)（SEM）、高效液相色譜法（HPLC）和槳法對AT原料藥、AT-NS1、AT-NS2的結(jié)構(gòu)特征、外觀形態(tài)及體外溶出度進(jìn)行分析、比較。取15只健康雄性SD大鼠隨機分為AT原料藥組、AT-NS1組和AT-NS2組，每組5只。分別單次灌胃相應(yīng)藥物混懸液120 mg/kg（均以水為溶劑），并于給藥前（0 min）及給藥后5、10、20、30、60、120、240、480 min自眼眶取血，以蘆丁為內(nèi)標(biāo)，采用HPLC法測定大鼠血漿中AT的質(zhì)量濃度，采用DAS 2.0軟件計算其藥動學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行比較。結(jié)果：AT-NS1和AT-NS2粒徑分別為（212.48±0.32）、（226.36±2.29）nm，PDI分別為0.129 3±0.026 3、0.254 7±0.012 4。XRD分析顯示，AT-NS1為無定型，AT-NS2為結(jié)晶型，兩者的衍射峰均與AT原料藥存在差異。SEM分析顯示，AT-NS1和AT-NS2形態(tài)相似，均呈圓球狀且大小均一；AT原料藥為塊狀，粒徑較大且大小不一。溶出度試驗結(jié)果顯示，1 h時，AT原料藥、AT-NS1和AT-NS2的累積溶出度分別為4.54%、35.01%、12.22%；12 h時，三者的累積溶出度分別為24.01%、81.14%、64.69%；24 h時，三者的累積溶出度分別達(dá)到36.04%、84.87%、85.86%。藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，與原料藥組比較，AT-NS1組和AT-NS2組大鼠的cmax、AUC0-∞以及AT-NS1組的t1/2z均顯著升高，AT-NS1組大鼠的tmax顯著縮短（P<0.05）；與AT-NS2組比較，AT-NS1組大鼠的cmax、AUC0-∞、t1/2z均顯著升高，tmax顯著縮短（P<0.05）。結(jié)論：將AT制備成NS后，可明顯增加其體外溶出，并促進(jìn)其體內(nèi)口服吸收；且在短時間內(nèi)，無定型NS比結(jié)晶型NS的溶出/吸收更快。

關(guān)鍵詞 落新婦苷；納米混懸劑；無定型；結(jié)晶型；溶出度；藥動學(xué)

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of crystal form on in vivo and in vitro behavior of Astilbin nanosuspensions （AT-NS）. METHODS： AT-NS1 and AT-NS2 were prepared by precipitation method and miniaturized media milling method respectively. The particle size and polydispersity index （PDI） were determined by laser particle size analyzer. X-ray diffraction （XRD）， scanning electron microscopy （SEM）， HPLC and paddle method were used to analyze and compare the structure characteristics， appearance morphology and in vitro dissolution of AT raw material， AT-NS1 and AT-NS2. Totally 15 healthy male SD rats were randomly divided into AT raw material， AT-NS1 and AT-NS2 group， with 5 rats in each group. They were given relevant medicine suspension 120 mg/kg （using water as solvent） intragastrically； blood samples were collected from orbit before medication （0 min） and 5， 10， 20， 30， 60， 120， 240， 480 min after medication. Using rutin as internal standard， HPLC method was used to determine plasma concentration of AT in rats. Pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 2.0 software and then compared. RESULTS： The particle sizes of AT-NS1 and AT-NS2 were （212.48±0.32） nm and （226.36±2.29） nm， respectively； PDI were 0.129 3±0.026 3 and 0.254 7±0.012 4. XRD analysis showed AT-NS1 was amorphous， and AT-NS2 was crystalline. Diffraction peaks of both were different from those of AT raw material. SEM analysis showed that AT-NS1 and AT-NS2 were similar in morphology， and they were spherical and uniform in size； AT raw material was lump with large particle size and different sizes. Results of dissolution tests showed that accumulative dissolution of AT raw material， AT-NS1 and AT-NS2 were 4.54%， 35.01%， 12.22% at 1 h； accumulative dissolution of them were 24.01%， 81.14%， 64.69% at 12 h； accumulative dissolution of them were 36.04%， 84.47%， 85.86% at 24 h， respectively. Results of pharmacokinetic study showed， compared with AT raw material group， cmax and AUC0-∞ of AT-NS1 and AT-NS2 groups as well as t1/2z of AT-NS1 group were increased significantly， while tmax of AT-NS1 group was significantly reduced significantly （P<0.05）. Compared with AT-NS2 goup， cmax， AUC0-∞ and t1/2z of AT-NS1 group were increased significantly， while tmax was reduced significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： When AT is prepared into NS， dissolution in vitro and oral absorption in vivo of AT are increased significantly. In a short time， the dissolution/absorption of amorphous NS is faster than crystalline NS.

KEYWORDS Astilbin； Nanosuspensions； Amorphous； Crystalline； Dissolution； Pharmacokinetics

落新婦苷（AT）為一種天然的二氫黃酮醇苷類化合物，存在于土茯苓等多種植物中，具有抗炎、抑制免疫、保肝護腎、抗氧化、抗糖尿病等多種藥理活性[1]。與環(huán)孢素A全面抑制各時相遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）以及Th1、Th2細(xì)胞相比，AT只影響DTH的效應(yīng)階段，且只抑制Th1細(xì)胞的活化；此外，AT導(dǎo)致腎臟及神經(jīng)毒性的可能性更低，故其免疫抑制作用的選擇性更高[2]，臨床應(yīng)用前景更為廣闊。但AT難溶于水，溶解度（25 ℃）僅為250 μg/mL[3]，在大鼠體內(nèi)的絕對生物利用度僅為0.066%[4]，口服吸收差，使得其開發(fā)利用受到了一定的限制。

納米給藥系統(tǒng)[包括納米混懸劑（NS）、納米脂質(zhì)載體、固體脂質(zhì)納米粒、納米乳等]可通過降低藥物粒徑、提高溶解度來有效解決難溶性藥物生物利用度低的問題[5]。與其他納米制劑相比，NS具有載藥量高、制備工藝簡單、給藥途徑多樣的優(yōu)點，可避免大量輔料可能導(dǎo)致的毒副作用[6-7]；同時在制備過程中無需將藥物先溶解至輔料內(nèi)，適用于水溶性、脂溶性均較差的藥物[6]。NS體外溶出及體內(nèi)代謝行為的影響因素是其現(xiàn)有研究的熱點之一，研究范圍涉及晶型、粒徑、穩(wěn)定劑種類、納米粒表面修飾劑等[8-9]。與結(jié)晶型相比，無定型藥物具有更高的自由能、更大的飽和溶解度及更快的溶出速率，因此其口服給藥的生物利用度更高[10-11]。但目前關(guān)于晶型的試驗性研究相對較少，故尚無法獲知晶型對NS體內(nèi)外行為的影響尚不明確。鑒于此，本研究采用不同方法制備了處方、粒徑一致但晶型不同的落新婦苷納米混懸劑（AT-NS），并以X射線衍射技術(shù)（XRD）、電鏡掃描技術(shù)（SEM）和高效液相色譜法（HPLC）對其進(jìn)行表征和體內(nèi)外行為研究，初步探討了晶型對NS體內(nèi)外行為的影響，以期為AT新劑型的篩選提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Winner 802型納米激光粒度儀（濟南微納科技有限公司）；DF101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（北京恒豐長偉科技有限公司）；S-4800型掃描電鏡（日本Hitachi公司）；D8-Advance型RD儀（德國Bruker公司）；ZRS-8G型智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；DGU-20A3型HPLC儀（日本Shimadzu公司）；N-1300D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；SHBⅢ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；TTL-DC型多功能氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；Kylin-Bell型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Spin215型微型高速離心機（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

AT原料藥（陜西錦泰生物工程有限公司，批號：JT160316，純度：80%）；AT對照品（批號：111798-201504，純度：93.9%）、蘆丁對照品（內(nèi)標(biāo)，批號：100080-201610，純度：91.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；聚維酮K30（PVP K30，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號：160502）；氧化鋯珠子（直徑：0.5 mm，長沙華尊陶瓷材料有限公司）；透析袋（截留分子量：8 000～14 000，美國Viskase公司，批號：20171112215）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級健康雄性SD大鼠，2月齡，體質(zhì)量為（220±20）g，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 AT-NS的制備及表型

2.1.1 沉淀法 稱取AT原料藥200 mg，溶于無水乙醇0.6 mL中，得溶液A；稱取PVP K30 100 mg，溶于水10 mL中，得溶液B；將溶液A迅速倒入溶液B中，以100 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌5 min后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，即得質(zhì)量濃度為16 mg/mL的AT-NS1。取適量AT-NS1，加水稀釋，使用納米激光粒度儀檢測其粒徑和多分散性指數(shù)（PDI），重復(fù)測定3次[12]。結(jié)果，AT-NS1的粒徑為（212.48±0.32）nm，PDI為0.129 3±0.026 3。

2.1.2 微型化介質(zhì)研磨法 稱取AT原料藥200 mg、PVP K30 100 mg，置于30 mL小瓶中，加水10 mL、氧化鋯珠子10 mL及攪拌子后，置于磁力攪拌器上，于0 ℃、避光條件下以800 r/min的轉(zhuǎn)速研磨24 h，即得質(zhì)量濃度為16 mg/mL的AT-NS2[13]。采用“2.1.1”項下方法檢測得AT-NS2的粒徑為（226.36±2.29）nm，PDI為0.254 7±0.012 4。

2.2 XRD分析

取AT原料藥、PVP K30、AT-NS1、AT-NS2各適量，經(jīng)冷凍干燥后，置于帶有凹槽的定性分析用塑料玻璃板材上，用毛玻璃片壓實，使用XRD儀進(jìn)行掃描分析。掃描范圍（2θ）：3～60 °，管壓：40 kV，管流：60 mA，掃描步長：0.02 °，掃描速度：2 °/min，發(fā)散和散射狹縫：1 °，接收狹縫：0.15 mm。結(jié)果，AT原料藥在3～30 °有明顯的晶體衍射峰，表明其具有晶體結(jié)構(gòu)特征；PVP K30無明顯的晶體衍射峰；AT-NS2仍具有與原料藥相似的晶體衍射峰，但強度和數(shù)目明顯減弱或減少，為結(jié)晶型；AT-NS1無類似特征衍射峰，為無定型，詳見圖1。

2.3 SEM分析

取AT原料藥、AT-NS1、AT-NS2各適量，經(jīng)冷凍干燥后，分別置于掃描電鏡下觀察其形態(tài)。結(jié)果，AT原料藥呈塊狀，粒徑較大且大小不一；AT-NS1和AT-NS2形態(tài)相似，均呈圓球狀且大小均一，粒徑在200 nm左右，詳見圖2。

2.4 體外溶出度檢測

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%醋酸溶液（19 ∶ 81，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：291 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 取AT對照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0.379 0 mg/mL的AT對照品貯備液。取上述AT對照品貯備液200 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為7.58 μg/mL的對照品溶液，備用。

2.4.3 供試品溶液的制備 取“2.1.1”項下AT-NS1 2 mL，放入透析袋中，參照2015年版《中國藥典》（四部）通則“溶出度與釋放度測定法”第二法（槳法）[14]，以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 4.5）500 mL為溶出介質(zhì)，控制轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為（37.0±0.5）℃。于溶出24 h時取樣1 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 專屬性考察 取AT對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液（即空白溶出介質(zhì)）適量，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，AT峰形良好，保留時間約為11.3 min；陰性對照溶液在上述保留時間處未見干擾，詳見圖3。

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.4.2”項下AT對照品貯備液各適量，加甲醇稀釋制得質(zhì)量濃度分別為0.95、1.89、3.79、7.58、15.16、30.32、45.48 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測物質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=26 271.11c-748.46（R2=0.999 8）。結(jié)果，AT檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.95～45.48 μg/mL。

2.4.6 定量限與檢測限考察 取“2.4.2”項下AT對照品貯備液各適量，加甲醇逐級稀釋，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結(jié)果，AT的定量限為0.13 μg/mL，檢測限為0.04 μg/mL。

2.4.7 精密度試驗 取“2.4.5”項下質(zhì)量濃度為7.58 μg/mL的AT標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，連續(xù)測定6 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD為1.43%（n=6），日間RSD為1.78%（n=36），表明儀器精密度良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批次AT-NS1，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，各時間點AT峰面積的RSD為0.99%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h基本穩(wěn)定。

2.4.9 重復(fù)性試驗 取同一批次AT-NS1，共6份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算AT的質(zhì)量濃度。結(jié)果，AT的平均質(zhì)量濃度為42.43 μg/mL，RSD為1.61%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，平行量取9份；分別精密加入質(zhì)量濃度為41.69 μg/mL的對照品溶液0.4、0.5、0.6 mL各3份（約相當(dāng)于樣品含量的80%、100%、120%），以溶出介質(zhì)定容至刻度，混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過。取續(xù)濾液適量，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，AT的加樣回收率分別為（100.09±2.40）%、（99.04±1.52）%、（97.75±0.95）%，RSD分別為2.40%、1.53%、0.97%（n=9）。

2.5 體外溶出特性考察

參照2015年版《中國藥典》（四部）通則“溶出度與釋放度測定法”第二法（槳法）[14]，分別取“2.1”項下AT原料藥混懸液（稱取AT原料藥200 mg，加水10 mL，攪拌均勻即得）、AT-NS1以及AT-NS2各2 mL，放入透析袋中，以PBS 500 mL為溶出介質(zhì)[10]，控制轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為（37.0±0.5）℃。分別于溶出0.5、1、2、4、8、12、16、20、24 h時取樣1 mL，并同時補充等體積溶出介質(zhì)。樣品液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并按公式計算藥物的體外溶出度（ρ）和累積溶出度，再采用Excel 2016軟件繪制體外溶出曲線。ρ=cnV2/m0，累積溶出度=ρn+（ρ1+ρ2+……+ρn-1）V1/V2[式中，cn為第n個取樣點樣品中AT的質(zhì)量濃度（由“2.4.5”項下回歸方程計算而得），m0為0 h時透析袋中AT的質(zhì)量；ρn為第n個取樣點的溶出度，V1為取樣體積，V2為溶出介質(zhì)體積]。上述試驗平行操作3次。AT原料藥、AT-NS1和AT-NS2的體外溶出曲線見圖4。

由圖4可知，1 h時，AT原料藥、AT-NS1和AT-NS2的累積溶出度分別為4.54%、35.01%、12.22%；12 h時，三者的累積溶出度分別為24.01%、81.14%、64.69%；24 h時，三者的累積溶出度分別達(dá)到36.04%、84.87%、85.86%。這提示將AT制備成NS后，其體外溶出度明顯提高；與AT-NS2相比，AT-NS1的體外溶出更快，但兩者在24 h時的累積溶出度相當(dāng)。

2.6 藥動學(xué)研究

2.6.1 色譜條件 除進(jìn)樣量為20 μL、流速為0.8 mL/min外，其余條件均同“2.4.1”項。

2.6.2 溶液的制備 取“2.4.2”項下AT對照品貯備液各適量，加甲醇稀釋制得質(zhì)量濃度分別為0.237、0.474、0.947、3.790、7.580、15.159 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。取內(nèi)標(biāo)（蘆丁）對照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為320 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

2.6.3 血漿樣品處理 取空白血漿200 μL，精密加入320 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液25 μL，渦旋混勻；加入乙酸乙酯1.5 mL，渦旋混勻2 min，10 000 r/min離心10 min；吸取1.4 mL上層有機相轉(zhuǎn)移至另一EP管中，以氮吹流吹干，殘渣加甲醇100 μL復(fù)溶后，13 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)樣測定[15]。

2.6.4 專屬性考察 取空白血漿、空白血漿+AT+內(nèi)標(biāo)、AT-NS1給藥30 min后的血漿樣品+內(nèi)標(biāo)，按“2.6.3”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，AT和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別約為14.9、9.5 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)無不干擾，詳見圖5。

2.6.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及定量下限的考察 取空白血漿200 μL，加入“2.6.2”項下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，得AT質(zhì)量濃度分別為0.030、0.059、0.118、0.474、0.947、1.895 μg/mL的血漿樣品，按“2.6.3”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測物質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=1.281 4x-0.012 0（R2=0.999 3）。結(jié)果，AT檢測血藥濃度的線性范圍為0.030～1.895 μg/mL，定量下限為0.030 μg/mL。

2.6.6 精密度試驗 按“2.6.5”項下方法配制AT定量下限濃度的血漿樣品以及低、中、高質(zhì)量濃度（0.030、0.059、0.947、1.516 μg/mL）的質(zhì)控樣品，按“2.6.3”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD分別為4.35%、2.19%、3.23%、2.03%（n=6），日間RSD分別為1.11%、2.36%、3.34%（n=18），表明精密度良好。

2.6.7 回收率試驗 按“2.6.5”項下方法配制AT低、中、高質(zhì)量濃度（0.059、0.947、1.516 μg/mL）的質(zhì)控樣品，按“2.6.3”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算質(zhì)量濃度。按“2.6.2”項下方法配制AT低、中、高質(zhì)量濃度（0.059、0.947、1.516 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，再按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。將質(zhì)控樣品的AT實測質(zhì)量濃度與其理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，考察方法回收率；將質(zhì)控樣品的AT峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的AT峰面積進(jìn)行比較，考察提取回收率。每個質(zhì)量濃度平行操作5次。結(jié)果，各質(zhì)控樣品的方法回收率為89.83%～98.77%（RSD<5%，n=5），提取回收率為80.14%～91.39%（RSD<5%，n=5），符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[14]，詳見表1。

2.6.8 穩(wěn)定性試驗 按“2.6.5”項下方法配制AT低、中、高質(zhì)量濃度（0.059、0.947、1.516 μg/mL）的質(zhì)控樣品，按“2.6.3”項下方法處理后，分別于室溫下放置0、8、12、24 h時按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，各質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品實測質(zhì)量濃度的RSD分別為2.45%、3.46%、2.51%（n=4），表明其在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.9 藥動學(xué)研究 取15只大鼠隨機分為3組，即AT原料藥組、AT-NS1組和AT-NS2組，每組5只。所有大鼠均禁食、不禁水12 h后，于次日晨起分別單次灌胃AT原料藥、AT-NS1和AT-NS2的混懸液（均以水為溶劑），劑量均為120 mg/kg[4，15]。分別于給藥前（0 min）及給藥后5、10、20、30、60、120、240、360、480 min自大鼠眼眶取血0.5 mL至肝素化EP管中，3 500 r/min離心7 min，分離上層血漿，按“2.6.3”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算AT的血藥濃度。采用Excel 2016軟件繪制平均藥-時曲線，結(jié)果見圖6；采用DAS 2.0軟件處理上述平均藥-時曲線數(shù)據(jù)，并以非房室模型（統(tǒng)計距法）[16]計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

由圖6可見，AT-NS1組和AT-NS2組大鼠的血藥濃度較AT原料藥組有明顯提高。由表1可見，與AT原料藥組比較，AT-NS1組和AT-NS2組大鼠的cmax、AUC0-∞以及AT-NS1組的t1/2z均顯著升高，AT-NS1組大鼠的tmax顯著縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，AT-NS1組和AT-NS2組大鼠的cmax分別是其原料藥的11.55、2.55倍，AUC0-∞分別是其原料藥的4.36、2.02倍。與AT-NS2組比較，AT-NS1組大鼠的cmax、AUC0-∞、t1/2z均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，AT-NS1組大鼠的cmax、AUC0-∞、t1/2z分別是AT-NS2組的4.54、2.16、1.90倍。與AT-NS2組比較，AT-NS1組大鼠的tmax顯著縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而AT-NS2組大鼠的tmax、t1/2z與原料藥組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

本研究初步探索了晶型對AT-NS表征、體外溶出度及體內(nèi)藥動學(xué)行為的影響，以期為NS口服吸收的研究提供參考。本研究首先參照2015年版《中國藥典》（一部）[17]，建立了測定AT體內(nèi)外濃度的HPLC法。本課題組前期考察了3種色譜柱[Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]的分離效果。結(jié)果顯示，Kromasil 100-5C18的分離效果最佳，且待測物色譜峰峰形良好，故最終以其作為HPLC分析的色譜柱。同時，本課題組對乙腈-0.1%醋酸溶液（19 ∶ 81，V/V）、乙腈-水（19 ∶ 81，V/V）、甲醇-0.1%醋酸溶液（39 ∶ 61，V/V）等3種流動相體系的分離效果進(jìn)行了評價。結(jié)果顯示，當(dāng)流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液（19 ∶ 81，V/V）時，待測物與內(nèi)標(biāo)基線分離，且峰形對稱，亦無內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，故最終以其作為HPLC分析的流動相。此外，本課題組還對血漿樣品處理的溶劑進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，與甲醇、乙腈相比，乙酸乙酯的萃取效率最高，故最終以其作為血漿樣品處理的萃取溶劑。

XRD分析結(jié)果顯示，AT原料藥在3～30 °內(nèi)有明顯的晶體衍射峰。與原料藥相比，AT-NS2仍有部分晶體衍射峰，但強度減弱、數(shù)量減少，為結(jié)晶型；AT-NS1無晶體衍射峰，為無定型。SEM分析結(jié)果顯示，AT原料藥為粒徑較大且大小不一的塊狀物；AT-NS1和AT-NS2形態(tài)相似，均呈圓球狀且大小均一。體外溶出度試驗和藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，與AT原料藥比較，AT-NS1和AT-NS2在24 h時的累積溶出度均明顯升高，且兩者在大鼠體內(nèi)的cmax、AUC0-∞均顯著升高，提示將AT制成NS后，可明顯增加其體外溶出，并促進(jìn)其體內(nèi)口服吸收。與AT-NS2比較，AT-NS1在12 h時的累積溶出度明顯升高，而兩者24 h時的累積溶出度相當(dāng)；AT-NS1組大鼠的cmax、AUC0-∞、t1/2z均顯著升高，提示晶型可對其體內(nèi)外行為造成影響。其中，AT-NS1較AT-NS2有更高的AUC和cmax，故可將需快速起效的藥物（如過敏等免疫性疾病治療藥物）制成結(jié)晶型NS；將日常保健用藥或糖尿病等慢性疾病治療藥物制成無定型NS。筆者認(rèn)為造成兩者體內(nèi)外行為差異可能是由于無定型NS較結(jié)晶型NS具有更高的吉布斯自由能和更高的飽和溶解度[11]；此外，根據(jù)Noyes-Whitney方程，提高NS的飽和溶解度可明顯提高藥物的溶出速率[18]。

綜上，本研究建立的HPLC法專屬性強，重復(fù)性好，精密度、回收率均較高，可用于AT濃度的測定及藥動學(xué)的研究。將AT制備成NS后，可明顯增加其體外溶出度，促進(jìn)其體內(nèi)口服吸收；且晶型對AT-NS的體內(nèi)外行為影響較大，無定型AT-NS比結(jié)晶型AT-NS在短時間內(nèi)溶出更快、體內(nèi)吸收更好。但本研究只初步考察了AT-NS的體外溶出和體內(nèi)藥動學(xué)特征，而晶型對AT-NS的體內(nèi)組織分布及藥效學(xué)的影響仍有待后續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2018-05-29 修回日期：2018-12-17）

（編輯：張元媛）