RP—HPLC法同時(shí)測定痢必靈片中6種成分的含量

徐陽 單柏宇 鮑慧瑋

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0454-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.05

摘 要 目的：建立同時(shí)測定痢必靈片中苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm（苦參堿、氧化苦參堿）、225 nm（沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果：苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.053～5.28 mg/mL（r=0.999 8）、0.125～12.54 mg/mL（r=0.999 9）、0.013～1.33 mg/mL（r=0.999 8）、0.169～16.94 mg/mL（r=0.999 9）、0.048～4.77 mg/mL（r=0.999 8）、0.072～7.16 mg/mL（r=0.999 9）；定量限分別為4.08×10-4、4.48×10-4、3.12×10-4、2.10×10-4、1.36×10-4、1.84×10-4 mg/mL，檢測限分別為1.24×10-4、1.50×10-4、1.02×10-4、6.20×10-5、4.20×10-5、6.40×10-5 mg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%（n=6）；加樣回收率分別為98.03%～101.43%（RSD=1.25%，n=6）、97.73%～102.26%（RSD=1.96%，n=6）、97.18%～101.41%（RSD=1.98%，n=6）、97.45%～102.11%（RSD=1.88%，n=6）、96.85%～101.07%（RSD=1.75%，n=6）、97.12%～102.64%（RSD=1.82%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡便，穩(wěn)定、快速，可用于同時(shí)測定痢必靈片中6種成分的含量。

關(guān)鍵詞 痢必靈片；反相高效液相色譜法；苦參堿；氧化苦參堿；沒食子酸；芍藥苷；木香烴內(nèi)酯；去氫木香內(nèi)酯；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of matrine， oxymatrine， gallic acid， peoniflorin， costunolide and dehydrocostus lactone in Libiling tablets. METHODS： RP-HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 210 nm （matrine， oxymatrine） and 225 nm （gallic acid， peoniflorin， costunolide， dehydrocostus lactone）. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 5 μL. RESULTS： The linear ranges of matrine， oxymatrine， gallic acid， peoniflorin， costunolide， dehydrocostus lactone were 0.053-5.28 mg/mL（r=0.999 8）， 0.125-12.54 mg/mL（r=0.999 9）， 0.013-1.33 mg/mL（r=0.999 8）， 0.169-16.94 mg/mL（r=0.999 9）， 0.048-4.77 mg/mL（r=0.999 8）， 0.072-7.16 mg/mL （r=0.999 9）. The limits of quantitation were 4.08×10-4， 4.48×10-4， 3.12×10-4， 2.10×10-4， 1.36×10-4， 1.84×10-4 mg/mL， respectively. The limits of detection were 1.24×10-4， 1.50×10-4， 1.02×10-4， 6.20×10-5， 4.20×10-5， 6.40×10-5 mg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. The recoveries were 98.03%-101.43% （RSD=1.25%， n=6）， 97.73%-102.26% （RSD=1.96%， n=6）， 97.18%-101.41% （RSD=1.98%，n=6）， 97.45%-102.11% （RSD=1.88%，n=6）， 96.85%-101.07% （RSD=1.75%， n=6）， 97.12%-102.64% （RSD=1.82%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： Established method is simple， stable and rapid， and can be used for simultaneous determination of 6 components in Libiling tablets.

KEYWORDS Libiling tablets； RP-HPLC； Matrine； Oxymatrine； Gallic acid； Peoniflorin； Costunolide； Dehydrocostus lactone； Content determination

痢必靈片是由苦參、白芍、木香等3味中藥提取制成的中藥成方制劑，其處方收載于2015年版《中國藥典》（一部）[1]。該藥具有清熱、去濕、止痢之功效，可用于治療大腸濕熱所致的痢疾、泄瀉、癥見發(fā)熱腹痛、大便膿血、里急后重。方中苦參的主要藥效成分為生物堿類化合物苦參堿和氧化苦參堿，其具有清熱燥濕的功效[2-3]；芍藥苷為白芍的指標(biāo)性成分，具有緩急止痛、抗炎、抑菌等作用[4]；木香中的倍半萜內(nèi)酯類化合物木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，是其發(fā)揮行氣止痛、調(diào)中導(dǎo)滯功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]；沒食子酸是3味中藥的共有成分，其在抗菌、抗病毒、抗炎等方面作用顯著[6]。2015年版《中國藥典》（一部）[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]中僅將苦參堿或芍藥苷作為痢必靈含量測定的指標(biāo)，但中藥的有效成分多而復(fù)雜，單一成分的含量測定在一定程度上不能準(zhǔn)確、全面地反映中藥質(zhì)量。為此，在本研究中筆者采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）建立了同時(shí)測定痢必靈片中苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量的方法，旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260型 HPLC儀，包括二極管全波長陣列檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度泵（美國Agilent公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（寧波江南儀器廠）；DHG-912A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；AB135-S型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；DP30A型單沖壓片機(jī)（北京國藥龍立科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

痢必靈片（長春中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號(hào)：20170801、20170802、20170803，規(guī)格：0.44 g/片）；苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110805-200815，純度：98%）、氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110780-200317，純度：98%）、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111524-200514，純度：92%）、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111525-200001，純度：95%）均購于中國食品藥品檢定研究院；沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201205，純度：98%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-200833，純度：98%）均購于南京景竹生物科技有限公司；甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；磷酸（分析純，北京化工廠）；純凈水（杭州娃哈哈股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm（苦參堿、氧化苦參堿）、225 nm（沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取苦參堿對(duì)照品5.28 mg、氧化苦參堿對(duì)照品12.54 mg、沒食子酸對(duì)照品1.33 mg、芍藥苷對(duì)照品16.94 mg、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品4.77 mg、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品7.16 mg，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）溶解并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末約2 g，置于25 mL具塞錐形瓶中，加甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按本品處方比例分別制備缺苦參、缺苦參-白芍-木香、缺苦參-白芍、缺苦參-木香的陰性樣品，并按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備各陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各待測成分與其他色譜峰均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于2 000，且在相同位置上陰性樣品對(duì)測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1、2、5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得系列線性關(guān)系工作溶液。精密量取上述系列線性關(guān)系工作溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，見表2。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的定量限分別為4.08×10-4、4.48×10-4、3.12×10-4、2.10×10-4、1.36×10-4、1.84×10-4 mg/mL，檢測限分別為1.24×10-4、1.50×10-4、1.02×10-4、6.20×10-5、4.20×10-5、6.40×10-5 mg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170801）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.71%、1.52%、1.33%、1.25%、1.72%、1.67%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170801）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.38%、0.90%、0.74%、0.50%、0.15%、0.71%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：20170801）粉末適量，共6份，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算各待測成分含量。結(jié)果，苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的平均含量分別為3.966、9.391、0.668、12.592、3.610、5.271 mg/g，RSD分別為0.80%、0.64%、0.82%、0.24%、0.50%、0.23%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20170801）粉末約1 g，共6份，分別加入混合對(duì)照品溶液（苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的質(zhì)量濃度分別為4.120、10.070、0.710、12.580、3.550、5.340 mg/mL）1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 耐用性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[分別以不同色譜柱（美國Agilent 公司ZORBAX SB-C18、TC-C18和美國Waters公司XBridge- C18）、流動(dòng)相（B）濃度比例（0.05%、0.10%、0.15%磷酸）、不同流速（0.95、1.00、1.05 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）]進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算各待測成分含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法能夠滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算各待測成分含量，結(jié)果見表5。

3 討論

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]，分別考察了不同提取方法（超聲提取法、回流提取法、溫浸法、索氏提取法）、不同提取溶劑（乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯）和不同提取時(shí)間（10、15、20、25、30 min）對(duì)提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑、超聲提取15 min時(shí)的提取效率最好。

筆者參考2015年版《中國藥典》（一部）[1]和相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]采用雙波長檢測各待成分。結(jié)果，檢測波長為210 nm（苦參堿、氧化苦參堿）、225 nm（沒食子酸、芍藥苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯）時(shí)的分離效果最好、檢測信號(hào)最強(qiáng)。

筆者又對(duì)不同流動(dòng)相組成（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液）和不同進(jìn)樣量（5、10、15 μL）進(jìn)行了比較。結(jié)果，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）、進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，各待測成分色譜峰與鄰近色譜峰分離度良好，出峰時(shí)間適宜。

綜上所述，本研究所建方法操作簡便，穩(wěn)定、快速，可用于同時(shí)測定痢必靈片中6種成分的含量。

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（收稿日期：2018-06-30 修回日期：2018-12-11）

（編輯：陳 宏）