UPLC/MS/MS法定性定量測(cè)定中藥材中3類27種合成色素

張甦　胡青　孫健　馮?！∮阢〖旧?/p>

摘要?目的：采用液相-固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)27種色素建立了準(zhǔn)確、靈敏的分析方法。方法：針對(duì)脂溶性、酸性和堿性3類色素分別采用不同的制備方法、色譜條件和電噴霧極性，采用4種不同藥用部位的代表性藥材進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果：表明方法線性關(guān)系良好（r≥0.997）;脂溶性和堿性色素的檢測(cè)限為0.03～3.87 ng/g，酸性色素為0.003～1.94 μg/g;準(zhǔn)確度和精密度分別為70%～105%和0.9%～6.8%;應(yīng)用于25個(gè)品種80批樣品的篩查。結(jié)論：所建方法可靠、高效、準(zhǔn)確，適用于中藥材復(fù)雜基質(zhì)中不同種類色素的測(cè)定。

關(guān)鍵詞?27種;合成色素;脂溶性;酸性;堿性;定性定量;中藥材;UPLC/MS/MS

Qualitative and Quantitative Determination of 27 Synthetic Dyes of 3 Species in Herbs by UPLC/MS/MS

Zhang Su1，2，Hu Qing1，Sun Jian1，F(xiàn)eng Rui1，Yu Hong1，Ji Shen1

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To develop a sensitive and accurate method combining liquid and solid phase extraction with ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry to analyze 27 dyes.Methods：Different preparations，chromatography conditions and polarity of ESI were applied for 3 categories of lipophilic，acidic and basic dyes respectively.Four species of herbs representing different parts of plant were selected for methodology observation.Results：The linear correlation coefficient was good（r ≥ 0.997）.The LODs of oil soluble and basic dyes were 0.03～3.87 ng/g and acid dyes were 0.003～1.94 μg/g respectively.The accuracies and precisions were 70%～105% and 0.9%～6.8% respectively.Conclusion：After detecting 80 samples of 25 species herbs，this method proved to be reliable，efficient and accurate in the detection of different kinds of dyes in the complex matrix of herbs.

Key Words?27 kinds; Artificial dyes; Lipophilic，Acidity; Basicity; Qualitative and quantitative determination; Herbs; UPLC/MS/MS

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.007

中藥主要為天然產(chǎn)物，隨著社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)身體健康愈加重視，市場(chǎng)對(duì)中藥的需求不斷增加，價(jià)格也水漲船高。由于當(dāng)前中藥生產(chǎn)、經(jīng)營秩序尚未完全規(guī)范，社會(huì)誠信體系缺失，監(jiān)管無法涉及所有環(huán)節(jié)，中藥染色、以劣充好等違法違規(guī)行為仍屢禁不止[1-3]。這些違法行為嚴(yán)重危害人民身體健康和生命安全、影響中醫(yī)中藥的聲譽(yù)和中醫(yī)藥事業(yè)的健康發(fā)展。特別是合成色素的添加，其特征的偶氮基團(tuán)（-N=N-）結(jié)構(gòu)，易被腸道菌群還原形成芳香胺類化合物[4]，可引起神經(jīng)毒性[5]、基因毒性[6]以及致癌性[7]。

目前，合成色素的分析方法包括薄層色譜法（TLC）[8]、毛細(xì)管電泳法（CE）[9]、離子色譜法[10]、高效液相色譜法（HPLC）[11-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[13-14]、液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法[15-16]等。本實(shí)驗(yàn)室已建立了快速檢測(cè)的薄層色譜法，粗略定量和定性的高效液相色譜法[17]以及用于定性的UHPLC-Q-TOF法[18]。這些方法可在不同水平的實(shí)驗(yàn)室用于不同處理過程的色素測(cè)定。本文重點(diǎn)闡述利用UPLC/MS/MS對(duì)色素同時(shí)進(jìn)行定量和定性分析。對(duì)3組色素的流動(dòng)相和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，為體現(xiàn)不同基質(zhì)的復(fù)雜性，選用4種不同藥用部位的代表性藥材進(jìn)行了方法學(xué)考察。應(yīng)用該方法對(duì)25個(gè)品種80批樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明該方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于中藥材基質(zhì)中染色色素的測(cè)定。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC/MS/MS），在正、負(fù)離子2種采集模式下，對(duì)復(fù)雜中藥基質(zhì)中的目標(biāo)化合物進(jìn)行了鑒定。Waters ACQUITY UPLC I-Class（Milford，Massachusetts，USA）由二元泵（BSM）、進(jìn)樣器（SM-FTN）和柱溫箱（CM-A）組成，配有AB Sciex API 4000 MS/MS系統(tǒng)（Framingham，Massachusetts，USA），采用Analyst 1.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.2?試劑?根據(jù)溶解性和酸堿性將色素對(duì)照試劑分為3組。見表2。對(duì)照試劑的生產(chǎn)廠家包括Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA），Dr.Ehrenstorfer GmbH（Augsburg，German），F(xiàn)luca（Buchs，Switzerland）and和NIFDC（中國國家食品藥品監(jiān)督管理局，北京）。在標(biāo)簽或分析證書上顯示對(duì)照試劑純度均超過80%。提取用甲酸、氨水、乙腈、甲醇為分析級(jí)試劑，購自國藥控股化學(xué)試劑有限公司（上海）。質(zhì)譜流動(dòng)相包括甲酸銨，甲酸和乙腈是LC/MS級(jí)，購自默克公司（KGaA，Darmstadt，Germany）。

1.3?分析樣品?選取了25種不同顏色的中藥材作為樣本，包括花、莖、根和果實(shí)等植物的典型部位。均為市售，包括山茱萸，黃連，丹參，槐米，大黃，制何首烏，烏梅，酸棗仁，醋延胡索，關(guān)黃柏，雞血藤，片姜黃，黃芩，茜草，蘇木，五味子，生蒲黃，紅花，番瀉葉，枸杞子，花椒，青黛，人工牛黃，松花粉，月季花，南五味子。上述前4種中藥材分別作為果實(shí)、根、莖、花的代表進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。以上均由上海華宇中藥材材有限公司（中國上海）提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?色譜柱采用Poroshell 120 EC-C18 column（3.0 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent，Palo Alto，CA，USA）。柱溫：40 ℃。正離子掃描模式下，流動(dòng)相為0.1%甲酸/20 mmol/L乙酸銨溶液（A）-乙腈（B）;負(fù)離子掃描模式下，流動(dòng)相為2 mmol/L乙酸銨溶液（A）溶液-乙腈（B），梯度洗脫程序見表1。流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣體積：1 μL。

2.2?質(zhì)譜條件?采用MRM監(jiān)測(cè)脂溶性色素和水溶性堿性色素洗脫液電離后的陽離子，水溶性酸性色素的電離后產(chǎn)生的陰離子。Q1和Q3質(zhì)量分析器的質(zhì)量選擇以單位分辨率為基準(zhǔn)。設(shè)定一個(gè)子離子用于定量，另一個(gè)用于定性。采用氮?dú)庾鳛殡x子源氣體1、離子源氣體2、氣簾氣、碰撞氣，流速分別控制在65、60、30、6 psi。電噴霧電壓正離子模式為5 500 V，負(fù)離子模式為-4 500 V。離子源溫度：600 ℃。利用27種色素的對(duì)照試劑溶液采用流注分析法（FIA）分別對(duì)去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）和代表性子離子進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化值見表2。

2.3?供試品溶液

根據(jù)色素的基本結(jié)構(gòu)，對(duì)不同色素采用不同的提取和制備方法，以確保色素的純化效率。

脂溶性色素：取藥材粗粉1 g，加乙腈25 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液作為供試品溶液。

水溶性堿性色素：取藥材粗粉1 g，加0.1%甲酸甲醇溶液25 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液5 mL，快速通過聚酰胺小柱（1 g，內(nèi)徑為1 cm，依次用甲醇3 mL和0.1%甲酸溶液3 mL預(yù)洗），流速約每分鐘5 mL/min，用60%（v/v）甲醇/水溶液（含0.1%甲酸）5.0 mL以低于5.0 mL/min的流速洗脫。洗脫液離心并用0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

水溶性酸性色素：除提取液（60%（v/v）甲醇/0.1%甲酸）為溶劑外，處理過程與堿性色素提取相同。洗脫溶液更改為8 mL甲醇-氨水-水（v/v，7∶2∶1）。洗脫液加入2 mL的25%甲酸溶液震搖，離心過濾通過0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4?對(duì)照試劑溶液

合成色素分成3組（O，B和A），配制濃度約為500 μg/mL的對(duì)照試劑儲(chǔ)備液。脂溶性組用乙腈溶解，其他2個(gè)水溶性組分別用水溶解。儲(chǔ)備液均保存于-4 ℃，根據(jù)需要稀釋至不同濃度。

2.5?色素的選擇和分組

食品中允許適當(dāng)使用色素，因此色素的限制重點(diǎn)在禁用的種類和過量使用。但中藥材中的色素情況卻不同。濫用色素的目的是冒充正品或以次充好，導(dǎo)致中藥材偽品質(zhì)量差，影響藥效，甚至對(duì)人體有害。因此中藥材中不允許添加色素。

本研究主要針對(duì)合成色素，包括報(bào)告公布的中藥材中已檢出色素（金胺O，亮藍(lán)等），在食品基質(zhì)中報(bào)道過的禁用色素（蘇丹系列和羅丹明B等），以及在食品中應(yīng)用的普通色素（莧菜紅，檸檬黃等）。選取了覆蓋不同色系和不同性質(zhì)色素，以擴(kuò)大方法的適用范圍。由于所選色素性質(zhì)不同，我們將其分為脂溶性、水溶性堿性和水溶性酸性3類。為了最大限度地提高提取和純化效率，對(duì)3組色素采用不同的前處理方案。

2.6?色素的提取

由于色素的溶解性和酸堿性存在差異，因此選用不同的溶劑提取色素。對(duì)脂溶性色素通過比較環(huán)己烷和乙腈的影響，最終選擇乙腈作為提取溶劑。對(duì)于水溶性色素，含0.1%甲酸的甲醇溶液有助于提取。對(duì)于酸性色素，考察了不同比例的甲醇-0.1%甲酸溶液。最終，60%（v/v）甲醇/水溶液（含0.1%甲酸）效果最好。具體內(nèi)容已在我們之前的研究中有所討論[17-18]。

作為中藥材的草本植物通常是干燥的，這與食品基質(zhì)有很大不同。一旦藥材被染色，帶有靜電荷的分子會(huì)強(qiáng)烈吸附在藥材纖維上，使得提取非常困難。為了最大限度地提取色素而非提取中藥材中的成分，與振搖、索氏提取和加熱回流進(jìn)行比較后，選擇超聲處理方式。

2.7?色素的純化

由于中藥材中色素檢測(cè)方法報(bào)道很少，參考食品中色素的不同純化方法。在多數(shù)情況下，制備方法會(huì)根據(jù)目標(biāo)色素的性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整，如氧化鋁、大孔樹脂、HLB[14]、聚酰胺[11]、離子交換SPE[15，20-21]。其中，由于酰胺基與色素的偶氮結(jié)構(gòu)之間存在氫鍵相互作用，聚酰胺對(duì)堿性色素和酸性色素的凈化均有良好的作用。

本文采用商品化的聚酰胺固相萃取小柱，簡化操作步驟，提高結(jié)果重復(fù)性。對(duì)堿性色素和酸性色素洗脫液pH值進(jìn)行考察。通過對(duì)填料規(guī)格、洗脫溶液比例和洗脫溶劑體積進(jìn)行優(yōu)化，最終測(cè)定條件如2.3所述。

2.8?流動(dòng)相優(yōu)化

由于脂溶性色素中偶氮鍵的存在以及堿性色素中季銨鹽的存在，含0.1%甲酸的流動(dòng)相可增強(qiáng)正離子的響應(yīng)，同時(shí)加入乙酸銨后峰形得到改善。流動(dòng)相不僅在分離方面表現(xiàn)良好，而且對(duì)這些化合物的響應(yīng)也表現(xiàn)良好。但酸性色素不是這樣。由于酸性色素含有硫酸根，緩沖鹽濃度越高，對(duì)峰響應(yīng)的抑制作用越大。當(dāng)乙酸銨濃度降低到2 mmol/L時(shí)，響應(yīng)增加了約50倍，并且對(duì)分離效果和峰形沒有干擾。見圖1。

2.9?母離子和子離子的選擇

所有質(zhì)譜參數(shù)均利用色素對(duì)照試劑溶液流注法進(jìn)行優(yōu)化。我們選擇一個(gè)響應(yīng)強(qiáng)的子離子作為MRM模式的定量離子，另一個(gè)作為定性離子。但對(duì)于某些酸性色素（亮藍(lán)色和亮黃色），由于含有對(duì)稱結(jié)構(gòu)和硫酸根導(dǎo)致[M-H]2-穩(wěn)定存在，而不是[M-H]-。所以我們選擇[M-H]2-作為母離子，及其子離子作為配對(duì)離子。

2.10?方法驗(yàn)證

以丹參、山茱萸、槐米、黃連分別代表的果、根、莖、花不同藥用部位進(jìn)行方法學(xué)研究。

2.10.1?線性關(guān)系

線性關(guān)系中脂溶性和堿性色素對(duì)照試劑濃度分別為0.05、0.1、1、10、50 ng/mL，酸性色素濃度分別為0.005、0.01、0.1、1和5 μg/mL。以各色素的峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，并通過計(jì)算相關(guān)系數(shù)，對(duì)線性回歸方程進(jìn)行評(píng)價(jià)。各相關(guān)系數(shù)均大于0.997，說明該方法線性關(guān)系良好。結(jié)果見表3。

2.10.2?檢測(cè)限

分別在4個(gè)樣品中加入線性標(biāo)準(zhǔn)中最低濃度的對(duì)照試劑溶液測(cè)定檢測(cè)限。以各色素3倍的信噪比（S/N）作為檢測(cè)限（LOD），脂溶性和堿性色素檢測(cè)限范圍分別為0.03～3.87 ng/g和0.003～1.94 μg/g。由此明顯可以看出負(fù)模式的響應(yīng)比正模式低10～100倍。結(jié)果見表3。

2.10.3?穩(wěn)定性

通過對(duì)同一批山茱萸樣品在24 h內(nèi)每隔4 h測(cè)定一次，進(jìn)行穩(wěn)定性分析。采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%RSD）作為穩(wěn)定性指標(biāo)。不同時(shí)間色素的峰面積經(jīng)比較差異較小，在1.2%～4.9%之間，說明樣品在測(cè)定條件下是穩(wěn)定的。見表3。

2.10.4?準(zhǔn)確度和精密度

通過測(cè)定加入4種藥材中的對(duì)照試劑含量考察方法準(zhǔn)確度。添加3個(gè)濃度水平的對(duì)照試劑計(jì)算平均回收率。結(jié)果表明分析方法準(zhǔn)確度較好，回收率在70.0%～105%之間（表4）。日落黃和羊毛綠結(jié)果均不佳，尤其是在槐花中。按照該方法對(duì)同一樣品重復(fù)進(jìn)樣6次驗(yàn)證方法精密度。

2.11?應(yīng)用

從市場(chǎng)中隨機(jī)購買25個(gè)品種80批中藥材。其中，11個(gè)樣品中檢出非法添加色素，檢出率高達(dá)13.8%。金胺O是一種高頻檢出色素，常見于大黃、大黃、紅花等黃色和紅色中藥材。金橙II和酸性紅18或73是另外2種常用色素，常見于丹參、紅花等紅色中藥材。在一批紅花樣品中同時(shí)檢出了4種色素。亮藍(lán)FCF和G是在制何首烏、烏梅等黑色中藥材中首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)的色素。根據(jù)表5所示的結(jié)果，中藥材中染色色素應(yīng)引起更多關(guān)注。

3?總結(jié)

通過聚酰胺固相萃取柱純化和UPLC-MS/MS相結(jié)合建立了中藥材中的27種色素準(zhǔn)確、靈敏的篩查方法。本方法結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，檢測(cè)限符合要求，分析時(shí)間短，可用于顏料類的常規(guī)分析。與食品基質(zhì)不同的，中藥材自身干燥，成分復(fù)雜，給方法的建立造成一定困難。本方法首次應(yīng)用于中藥材中的非法添加色素，結(jié)果應(yīng)引起更廣泛的重視。未來的研究將報(bào)道進(jìn)一步改進(jìn)后的制備方法和檢測(cè)技術(shù)。

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