基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的黃芪注射液中化學(xué)成分分析

于泓　胡青　孫健　馮?！埉d　張靜嫻　毛秀紅　季申

摘要?目的：基于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（Ultra-performance Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS）對黃芪注射液物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了全面的研究，建立及黃芪注射液中有關(guān)成分的快速準(zhǔn)確的分析方法。方法：采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（3 mm×100 mm，1.8 μm），以含0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫，流速0.4 mL/min;電噴霧源（ESI），Q-TOF-MS作檢測器，正、負(fù)離子模式檢測;甲醇稀釋樣品;與對照品保留時間、母離子及碎片離子精確分子量，比對準(zhǔn)確定性。結(jié)果：共鑒定黃芪注射液中的46個化合物，包括氨基酸，黃酮，皂苷，核苷和煙酸等。結(jié)論：建立了黃芪注射液中的復(fù)雜化學(xué)成分的快速檢測和評價方法，為其的質(zhì)量控制及工藝改進(jìn)提供參考。

關(guān)鍵詞?黃芪注射液;黃芪;化學(xué)成分;Q-TOF-MS;皂苷;黃酮;氨基酸;核苷

Comprehensive Screening of Multi-components in Huangqi Injection by Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole-time-of-flight Mass Spectrometry

Yu Hong，Hu Qing，Sun Jian，F(xiàn)eng Rui，Zhang Su，Zhang Jingxian，Mao Xiuhong，Ji Shen

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To study comprehensive screening multi-components in Radix Astragali and Huangqi injection，based on high-resolution quadrupole-time-of-flight mass spectrometry.Methods：The analysis was performed by Agilent Eclipse Plus C18 column（3 mm × 100 mm，1.8 μm）with the mixture of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile as mobile phase by gradient elution，and the flow rate was 0.4 mL/min.Q-TOF-MS equipped with ESI ion source was performed in both positive and negative ionization.Samples were diluted with methanol.Qualitative analyze was based on retention time，the accurate mass of the precursor ion and product ions.Results：A total of 46 components including amino acids，flavonoids，saponins，nucleosides and nicotinic acid were successfully identified or tentatively characterized.Conclusion：This study is expected to provide an effective pattern for systematic characterization of the complex Huangqi injection systems，and establish a reliable strategy for its quality evaluation，also offers a reference for quality control as well as technological improvement.

Key Words?Huangqi injection; Radix Astragali; Components; Quadrupole-time-of-flight mass spectrometry; Saponins; Flavonoids; Amino acids; Nucleosides

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.005

黃芪注射液是我國較早開發(fā)的中藥注射液品種之一，是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪干燥根的水提滅菌溶液，具有廣泛的藥理作用。皂苷類、黃酮類、氨基酸類成分為其功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。具有益氣養(yǎng)元，扶正祛邪，養(yǎng)心通脈，健脾利濕的功效。廣泛應(yīng)用于心氣虛損，血脈瘀阻之病毒性心肌炎[2]，心腦血管疾病[3-4]及腎臟疾病[5]等。急性毒性試驗、長期毒性試驗[6]以及臨床研究均表明：黃芪注射液效果確切，不良反應(yīng)較少[7]，是具有研究和開發(fā)價值的中藥注射劑品種[8]。為了提高黃芪注射液的質(zhì)量，降低不良反應(yīng)發(fā)生概率，亟待對其化學(xué)成分進(jìn)行深入研究。

成分的復(fù)雜和缺乏對照品，是中藥及天然產(chǎn)物分析的共同難題。液相色譜串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF-MS），且具有較高的選擇性和靈敏度，近年來也常被用于中藥和天然藥物的成分分析[9-12]?？蓪?shí)現(xiàn)非目標(biāo)的成分分析模式[13-14]，利于未知化合物的發(fā)現(xiàn)和鑒定。

本研究采用超高效液相串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜，根據(jù)精確分子量和碎片離子信息，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[15]，鑒定了46種化合物，其中24種已通過對照品確證。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

Agilent 1290 Infinity高效液相色譜儀，Agilent 6550 Q-TOF質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），Sartorius MSU225P-1CE-DU分析天平（德國Sartorius公司），超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。甲醇、鹽酸和乙酸乙酯為分析純試劑（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）;質(zhì)譜用水和乙腈為LC-MS級試劑（德國Merck公司），甲酸為色譜純試劑（德國Merck公司）;質(zhì)譜所用參比液，調(diào)諧液均為美國Agilent公司提供。

1.2?試劑

標(biāo)準(zhǔn)對照品：蘇氨酸（Threonine，A2），谷氨酸（Glutamic acid，A3），脯氨酸（Proline，A4），纈氨酸（Valine，A5），L-異亮氨酸（L-isoleucine，A6），酪氨酸（Tyrosine，A7），L-亮氨酸（L-Leucine，A8），苯丙氨酸（Phenylalanine，A8），胸腺嘧啶脫氧核苷（Thymidine，A9），色氨酸（Tryptophan，A10），煙酸（Nicotinic acid，O1），尿苷（Uridine，O2），腺苷（Adenosine，O3），毛蕊異黃酮-7-葡糖苷（Calycosin-7-glucoside，F(xiàn)4），染料木苷（Genistin，F(xiàn)6），芒柄花苷（Ononin，F(xiàn)9），毛蕊異黃酮（Calycosin，F(xiàn)12），芒柄花素（Formononetin，F(xiàn)14），黃芪甲苷（Astragaloside IV，S6）均購于中國藥品生物制品檢定所。Methylnissolin 3-O-glucosid（F10），黃芪皂苷I（Astragaloside I，S14），黃芪皂苷II（astragaloside II，S8），環(huán)黃芪醇（Cycloastragenol，S17）和黃芪皂苷III（astragaloside III，S7）購于上海同田生化技術(shù)有限公司。

黃芪注射液分別由6家生產(chǎn)廠家提供。1 mL注射劑分別相當(dāng)于2 g黃芪。其中樣品A1和A2工藝中使用增溶劑;樣品B1，B2，B3和B4不添加任何增溶劑。

1.3?分析樣品

黃芪注射液樣品以甲醇稀釋10倍和100倍（v/v）。在14 000 r/min離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)移到自動進(jìn)樣器小瓶中進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液以甲醇制備，-4 ℃儲存。

1.4?UPLC條件

Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（3 mm×100 mm，1.8 μm）;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣體積：2 μL;流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度洗脫程序：0～2 min：3% B;3～17 min：3%～70% B;18～22 min：95% B;23～25 min：3% B。流速：0.4 mL/min。

1.5?Q-TOF-MS條件

質(zhì)譜條件：采集模式：正模式;掃描范圍：m/z 70～1 300.離子源參數(shù)：霧化氣（N2）：35 psi;干燥氣（N2）：流速15 L/min，溫度200 ℃;鞘氣（N2）：流速12 L/min，溫度350 ℃;毛細(xì)管電壓3.5 kV;碎裂電壓250 V;CID電壓：5～40 eV;參比離子：正模式：m/z121和922;負(fù)模式：m/z 112和1 033。碰撞誘導(dǎo)解離（CID），能量從6～70 eV，每個化合物單獨(dú)優(yōu)化。

1.6?數(shù)據(jù)分析

通過文獻(xiàn)檢索，建立包含可能存在的近200個蒙古黃芪和膜莢黃芪藥材中所含成分的初級譜庫[15-17]，數(shù)據(jù)庫通過MassHunter PCDL Manager軟件建立，包含化合物名稱，精確分子量，分子式，分子結(jié)構(gòu)。采集的數(shù)據(jù)文件通過Agilent′s MassHunter Qualitative軟件與譜庫進(jìn)行匹配分析。

通過精確分子量匹配（<1 ppm），根據(jù)其可能的的化學(xué)結(jié)構(gòu)將化合物分類。通過碰撞誘導(dǎo)解離（CID）得到二級譜信息，盡可能減少對化合物的誤判。對于對照品可能獲得的化合物，通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間，二級譜匹配等信息進(jìn)一步確定。對于難以獲得標(biāo)準(zhǔn)品的化合物通過二級光譜與文獻(xiàn)報道的離子碎片等進(jìn)行比對。

2?結(jié)果與討論

2.1?UPLC/Q-TOF-MS的共有化合物的分析結(jié)果

分別在正負(fù)2種模式下采集，黃芪注射液中共鑒定出46個共有化合物（圖2）。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)將46種組分分為4組：氨基酸（A），黃酮類（F），皂苷（S）和其他（O）。表2為46化合物的主要碎片譜峰歸屬。

2.2?主要黃酮化合物的鑒定

17種黃酮類化合物分屬于4種黃酮結(jié)構(gòu)類型：黃酮，異黃酮，異黃烷以及紫檀烷類。二級譜質(zhì)譜圖中，可見丟失CH3，CO（C-4），CHO（C-OH）和脫H2O（3-OH，5-OH或m-OH，o-OH）的碎片離子。通過黃酮類C環(huán)的逆Diels-Alder（RDA）裂解，得到關(guān)于A環(huán)和B環(huán)中取代基的數(shù)量和類型的信息。

圖1a和圖1d顯示了峰F14的一系列碎片離子（m/z 269.0808）解析機(jī)理如圖所示。黃酮苷類結(jié)構(gòu)較為脆弱，容易在低碰撞電壓下裂解甚至在ESI離子源內(nèi)碎裂，因此會同時產(chǎn)生苷和苷元的“[M+H]+”。因此可將黃酮苷元及糖苷進(jìn)行分類分析，例如：圖1中F9和F14的結(jié)構(gòu)解析過程。F9（m/z 431.132 7）保留時間9.8 min。在低碰撞電壓（<10 eV）下質(zhì)譜相對簡單，僅含有一個子離子，m/z為269.0801，與峰值F14相同（圖1b）。當(dāng)碰撞電壓增加到60V時，F(xiàn)9的二級質(zhì)譜顯示與F14非常相似，說明F9可能在結(jié)構(gòu)上與F14相似。F9比F14分子量多162 Da，推導(dǎo)F9可能是芒柄花苷（Ononin），并用對照品進(jìn)一步確認(rèn)了保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用上述方法又繼續(xù)鑒定了另外3對類黃酮及其糖苷（F4和F12，F(xiàn)5和F13，F(xiàn)10和F15）。F1和F2具有相似的二級質(zhì)譜圖，且F1比F2分子量多162 Da（C6H10O6）。推測具相同苷元的不同異黃酮糖苷。

在研究中發(fā)現(xiàn)，黃酮類有幾組同分異構(gòu)體，如F2和F8（C22H22O11，m/z 463.123 5）。在數(shù)據(jù)庫中，得到3個候選化合物：紅車軸草素7-O-葡萄糖苷（pratensein 7-O-glucoside），鼠李糖苷3-O-葡糖苷（rhamnocitin 3-O-glucoside）和山柰素3-O-葡萄糖苷（kaempferide 3-O-glucoside）。[M+H]-離子的二級質(zhì)譜顯示它們都具有分子量301.070 6（C16H13O6）的苷元碎片離子。峰F8在RDA機(jī)理中斷裂的m/z 153和134碎片表明它在A環(huán)和B環(huán)中皆含有2個羥基官能團(tuán)，所以紅車軸草素7-O-葡糖苷是唯一的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)[18]，F(xiàn)2可鑒定為鼠李糖苷3-O-葡糖苷。F3和F4具有非常相似的結(jié)構(gòu)，將保留時間與對照品進(jìn)行比較，確認(rèn)F4為毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷（calycosin-7-O-glucoside），而F3可能為3′-hydroxy-5′-methoxyisoflavone-7-O-glucoside。

2.3?主要皂苷類化合物的鑒定

黃芪中大部分皂苷類成分均屬于C-17位帶有一個呋喃環(huán)的環(huán)阿屯烷型四環(huán)三萜皂苷。通常情況下，環(huán)阿屯烷類皂苷在0.1%甲酸-乙腈系統(tǒng)中，正模式下具有顯著的[M+Na]+和較低豐度的[M+H]+;或者負(fù)模式下顯著的[M+COOH]-。另外，皂苷類結(jié)構(gòu)在ESI+模式下特征顯著，由于其母離子在離子源內(nèi)容易碎裂，即使在較為溫和的條件下，質(zhì)譜圖上也會表現(xiàn)為一簇一簇的碎片離子[15]。而此類皂苷類結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜行為恰好可以作為一個快速識別及判斷環(huán)阿屯型皂苷類結(jié)構(gòu)存在的方法。本研究中，皂苷類結(jié)構(gòu)出峰時間在11分鐘以后，其結(jié)構(gòu)分析采用正負(fù)2種模式下分別采集質(zhì)譜信息相結(jié)合分析。

以黃芪甲苷IV（S4，Astragaloside IV）為代表的皂苷類成分，質(zhì)譜中碎裂特征明顯。圖2所示正模式的質(zhì)譜圖上出現(xiàn)規(guī)律的成簇的復(fù)雜離子信號，低碰撞能量的二級譜與之幾乎相同。A組中為母離子及其一系列脫水離子信號;B組中為母離子脫去C-6葡萄糖或者C-3木糖，以及其一系列的脫水離子信號;C和D組幾乎可以在所有以環(huán)黃芪醇m/z 437.341 4（C30H45O2）為苷元的黃芪皂苷中觀察到的一組信號，其中C組包含苷元離子碎片以及其一系列脫水離子的信號;D組主要為2個環(huán)黃芪醇骨架的特征離子碎片m/z 143.106 7（C8H15O2）和125.096 6（C8H13O），是C-17和C-20之間斷裂產(chǎn)生的呋喃環(huán)的離子碎片。另外，采集負(fù)模式下的[M+COOH]-離子的二級譜，可以獲得苷元離子碎片489.357 7（C30H50O5，），以及脫木糖的[M-H-xyl]-離子碎片 m/z 651.412 3（C36H59O10）。一般皂苷C-3位的苷鍵較C-6位容易斷裂[19]。從而可以區(qū)別與黃芪甲苷為同分異構(gòu)體的黃芪皂苷III（S7）。

同類型皂苷分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)阿屯型皂苷的質(zhì)譜行為具有極強(qiáng)的規(guī)律性，具有相同苷元骨架，且裂解途徑相同。通過正負(fù)模式下綜合分析，可以基本確認(rèn)環(huán)阿屯型皂苷存在。正模式下，即可通過其離子源內(nèi)裂解產(chǎn)生的成簇存在的碎片離子;以及通過提取特征碎片離子m/z 437.341 4，143.106 7和125.096 6快速的定位以及辨認(rèn)環(huán)阿屯型皂苷。如圖3所示，通過提取特征離子437.3414可以定位大部分環(huán)阿屯型皂苷。而負(fù)模式下采集的二級譜信息，可以提供皂苷上糖連接位置以及類型的信息。通過上述方法綜合分析，本研究在黃芪注射液中中共分析得到16個環(huán)阿屯型皂苷和一個齊墩果烷型皂苷，其中5個化合物與標(biāo)準(zhǔn)品確證。

此外，我們還觀察到實(shí)驗中異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化（S6和S7;S8，S12和S13;S14，S15和S16）。在室溫下儲存數(shù)小時后，對照品溶液中發(fā)生異構(gòu)化現(xiàn)象（圖4）：S7部分轉(zhuǎn)化為S6;S8轉(zhuǎn)換為S12，S13;并且S14轉(zhuǎn)換為S15，S16。異構(gòu)體通常在黃芪注射液中共存，其不穩(wěn)定性可能是由糖苷鍵或乙?；漠悩?gòu)化或分子構(gòu)型的變化引起的。并且實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)甲醇溶液提取黃芪皂苷可以抑制異構(gòu)現(xiàn)象的發(fā)生，而水溶液提取黃芪皂苷時會促進(jìn)異構(gòu)現(xiàn)象發(fā)生。

2.4?氨基酸及其他化合物的鑒定

基酸類成分在反柱上一般難以保留和分離。使用高分辨率質(zhì)譜可將氨基酸類成分從復(fù)雜的背景信號中提取出來，但由于基質(zhì)效應(yīng)影響嚴(yán)重并不能很好的識別和鑒定。本研究中共分析得到10種氨基酸化合物。通常氨基酸類成分在甲酸系統(tǒng)正模式下表現(xiàn)為較強(qiáng)的[M+H]+，二級譜中主要以[M+H-COOH]+或[M+H-NH3]+離子碎片為主。其中9個化合物與對照品保留時間以及質(zhì)譜相關(guān)信息確證。

黃芪注射液中還存在煙酸（O1），尿嘧啶（O2），和腺苷（O3）。均與標(biāo)準(zhǔn)品比對，確證。另外，O4（C10H14N2O5）在黃芪相關(guān)文獻(xiàn)中并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)信息，其分子式與胸苷一致，但碎片離子與胸苷標(biāo)準(zhǔn)品不一致。

3?結(jié)論

本研究中采用UPLC/Q-TOF/MS法，研究建立了黃芪注射液快速準(zhǔn)確成分分析方法。在研究方法條件下，在6個廠家注射液中共分析得到46個共有化合物，其中24個已通過標(biāo)準(zhǔn)品驗證。研究中還歸納了不同類型化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律，為同類型化合物成分分析提供參考。

基于成分分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)6廠家黃芪注射液產(chǎn)品質(zhì)量非常大。除黃芪藥材質(zhì)量的影響因素外，各廠家生產(chǎn)工藝不同，應(yīng)該是注射液產(chǎn)品質(zhì)量影響的主要因素。因此，統(tǒng)一黃芪注射液生產(chǎn)工藝是非常必要的。另外添加增溶劑，可以極大的改善黃芪甲苷等皂苷類成分的含量，但注射液中使用吐溫80等增溶劑存在一定風(fēng)險[20]。另外在研究中發(fā)現(xiàn)，部分環(huán)阿屯烷型皂苷在水溶液中的異構(gòu)現(xiàn)象;對黃芪注射液工藝改進(jìn)具指導(dǎo)意義。

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