QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定三七中26種真菌毒素

王少敏　杜春曉　劉賢賢　劉冠萍　毛丹　梁云飛　黃曉靜　朱小鳳　陳鈳　季申

摘要?目的：采用改良QuEChERS前處理技術(shù)，建立了超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra-High-performance Liquid Chromatography-TandemMass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）檢測中藥三七中26種真菌毒素含量的分析方法。方法：樣品用QuEChERS方法進(jìn)行前處理，經(jīng)15%甲酸乙腈溶液提取，用混合凈化填料凈化除雜，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果：在低、中、高3個添加水平下，26種真菌毒素的平均加標(biāo)回收率為80.1%～116.2%（n=5），平均回收率范圍為26種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）≥0.99，檢出限和定量限分別為0.05～6.25 μg/kg和0.2～20.0 μg/kg。結(jié)論：該法簡單、快速、實(shí)用性強(qiáng)，適用于三七中26種真菌毒素的定量分析。

關(guān)鍵詞?QuEChERS;真菌毒素;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;三七;同時測定;黃曲霉毒素;赭曲霉毒素;恩鐮孢菌素

Simultaneous Determination of 26 Mycotoxins in Notoginseng Radix et Rhizoma by QuEChERS-Ultra-High-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Wang Shaomin1，Du Chunxiao1，Liu Xianxian1，Liu Guanping2，Mao Dan1，Liang Yunfei2，Huang Xiaojing1，Zhu Xiaofeng2，Chen Ke1，Ji Shen1

（1 Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China; 2 Guangxi Wuzhou Pharmaceutical（Group）Co.，Ltd，Wuzhou 543002，China）

Abstract?Objective：To establish a method for the simultaneous determination of 26 kinds of mycotoxins in traditional Chinese medicine Notoginseng Radix et Rhizoma using a QuEChERS pretreatment procedure coupled with ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UHPLC-MS/MS）.Methods：The samples were pretreated with QuEChERS method，extracted with 15% formic acid in acetonitrile，purified by mixed absorbents，as well as analyzed by UHPLC-MS/MS.Matrix-matched calibration curves and internal standards were used for accurate quantification.Results：Satisfactory recoveries at low，medium and high spiked levels were ranged from 80.1% to 116.2%（n=5）.Good linear relationships were obtained and the correlation coefficients（r2）were greater than 0.99.The limits of detection（LODs，S/N=3）and quantification（LOQs，S/N=10）ranged from 0.05 μg/kg to 6.25 μg/kg and from 0.2 μg/kg to 20.0 μg/kg，respectively.Conclusion：The proposed method is simple，rapid and valuable，which can be a powerful tool for quantitative analysis of the 26 mycotoxins in Notoginseng Radix et Rhizoma.

Key Words?QuEChERS; Mycotoxins; Ultra-High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Notoginseng Radix et Rhizoma; Simultaneous Determination; aflatoxins; Ochratoxins; Enniatins

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.003

近年來，中藥中真菌毒素安全性問題引起了國內(nèi)外的高度重視。真菌毒素是真菌的有毒代謝產(chǎn)物，可通過直接攝取、吸入以及皮膚接觸進(jìn)入人體及牲畜體內(nèi)，引起嚴(yán)重的慢性毒性，包括肝、腎毒性、致癌性、致突變性及致畸性等。研究較多且感染范圍較廣的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族類等[1-2]，近年來新的真菌毒素種類也在不斷被發(fā)現(xiàn)，如恩鐮孢菌素類[3]。

目前單個或單類真菌毒素檢測方法較為成熟[4-5]，主要采用免疫親和凈化前處理方法聯(lián)合液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)。而真菌毒素高通量檢測，由于不同真菌毒素產(chǎn)自不同真菌的代謝途徑，化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，理化性質(zhì)差異大，且含量低，通常為μg/kg級別的痕量檢測，檢測難度較大。目前主要采用靈敏度高、專屬性強(qiáng)的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測，液相串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)可采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，通過采集母離子與對應(yīng)子離子對，有效排除干擾，同時靈敏度高于其他全掃描高分辨質(zhì)譜，是目前最常用的真菌毒素高通量檢測方法。前處理方面主要采用固相萃取柱、分散固相萃取方法進(jìn)行凈化富集，其中QuEChERS方法以其多種凈化填料組合高效去除多種雜質(zhì)，且操作簡便快速的特點(diǎn)，成為目前應(yīng)用較多的方法。

目前高通量真菌毒素方法率先在食品領(lǐng)域中研究，研究基質(zhì)多為食品與飼料[6-10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥在種植、加工、流通與貯存中均存在感染真菌毒素的風(fēng)險。但中藥基質(zhì)富含各種次生代謝產(chǎn)物，基質(zhì)干擾更多，無法直接套用食品方法。三七是一味重要的傳統(tǒng)中藥，可“散瘀止血，消腫定痛”，既具縮短出血和凝血時間又兼具抗血小板凝聚和溶栓的作用，被臨床和日常保健大量應(yīng)用[11-12]。但三七種植在溫暖潮濕的南方，在種植、貯存及運(yùn)輸中易霉變，為進(jìn)一步研究三七真菌毒素的安全性，本課題組以三七為基質(zhì)，利用QuEChERS前處理技術(shù)[13]并進(jìn)行改良，聯(lián)合液質(zhì)技術(shù)首次建立了三七中26種真菌毒素檢測方法。可同時檢測黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、伏馬毒素類、單端孢霉烯類、青霉素類及恩鐮孢菌素類多種真菌毒素，且操作簡便，準(zhǔn)確，快速、為探索其他中藥基質(zhì)中真菌毒素高通量檢測方法提供了借鑒。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（型號：Nexera X2-LCMS8060，供應(yīng)商：日本島津公司）;高速離心機(jī)（型號：5810R，供應(yīng)商：德國Eppendorf公司）;組織粉碎機(jī)（型號：Genogrinder 1500，美國SPEX公司）;氮吹儀（型號：N-EVAPTM-112，供應(yīng)商：美國Organomation公司）;分析天平（型號：Statorius CP225D，供應(yīng)商：美國梅特勒-托利多儀器有限公司）;Milli-Q純水儀（型號：Milli-Q，供應(yīng)商：美國密理博公司），VA22MFD超聲儀（型號：VA22MFD，德國WIGGENS公司）。

1.2?試劑?甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨、醋酸銨（色譜純，購于德國Merck公司）;無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），C18、GCB、PSA凈化填料均購于天津博納艾杰爾公司;真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品、同位素內(nèi)標(biāo)13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（1 mg/L）、13C18-玉米赤霉酮（1 mg/L）（純度均大于98%，均購于美國Sigma 公司）。

1.3?分析樣品?實(shí)驗(yàn)用三七樣品分別取自廣西省百色市、云南省紅河自治州石屏縣三七種植基地各18批，依次編號為廣西01，廣西02……廣西18，云南01、云南02……云南18。

2?方法與結(jié)果

2.1?LC-MS/MS色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：采用粒徑為2.7 μm的安捷倫Poroshell 120 EC-C18的色譜柱（規(guī)格：150 mm×3.0 mm）;采用正負(fù)離子2種采集模式。正離子模式：流動性A相為甲醇，B相為0.5%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液，梯度洗脫條件：0～2 min：20% A，2～15 min：20%A～100% A;15～18 min：100% A;負(fù)離子模式：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫條件：0～2 min：10% A，2～15 min：10%B～100% A。流速0.45 mL/min，進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），正、負(fù)2種模式進(jìn)行掃描，相關(guān)參數(shù)為：離子源接口溫度：300 ℃，接口電壓：4 000 V，霧化氣流速：3.0 L/min;干燥氣流量：10.0 L/min，加熱氣流量：10.0 L/min;26種毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1，總離子流圖見圖1。

2.2?對照品溶液的制備

取26種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈稀釋成濃度為每1 L含100 mg的單個標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再用乙腈配制成每1 L含1 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。再取13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、13C18-玉米赤霉酮2種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為每1 L含20 μg的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3?供試品溶液的制備

稱取三七粉末（過三號篩）約2 g，置50 mL離心管中，加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液，放置1 h待內(nèi)標(biāo)溶液揮干，加水15 mL放置5 min，加15%甲酸乙腈溶液10 mL勻漿2 min，加硫酸鎂氯化鈉混合鹽包5 g（4∶1），震搖30 min，離心，吸取上清液6 mL至離心管中，加入1.5 g混合凈化填料（GCB∶PSA∶C18∶MgSO4=30∶150∶300∶900），劇烈振搖5 min，離心，取上清液2 mL于40 ℃氮?dú)獯抵良s近干，加入20%甲醇溶液稀釋至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4?專屬性考察

取經(jīng)預(yù)先測定，不含上述真菌毒素的三七樣品，按照“2.3”項(xiàng)下操作，制備空白供試品溶液;同時在樣品中添加“2.2”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“2.3”項(xiàng)下操作，制備加標(biāo)供試品溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中其他成分不干擾測定。

2.5?線性關(guān)系考察

取真菌毒素未污染的三七樣品，按供試品前處理方式制備空白基質(zhì)溶液，將適量的26種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備液和10 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液混合，配制不同線性范圍的系列空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立了26種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。26種真菌毒素在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均≥0.99。以定性通道的3倍信噪比（S/N）確定化合物的檢出限（LOD）、定量通道的10倍信噪比確定化合物的定量限（LOQ），檢出限和定量限分別為0.05～6.25 μg/kg和0.2～20.0 μg/kg。

2.6?中間精密度試驗(yàn)?精密吸取混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6此，記錄峰面積及，結(jié)果各真菌毒素的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7?供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一份添加濃度為25倍定量限的加樣回收試驗(yàn)供試品溶液，分別在0、6、12、18、24 h進(jìn)樣，測定峰面積，RSD均小于4.1%。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8?重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

采用加樣方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，按“2.8”項(xiàng)下制備添加濃度為20 μg/kg的瓜蔞皮和提取物供試品溶液，一式6份，進(jìn)樣分析，26種真菌毒素的重復(fù)性結(jié)果（日內(nèi)精密度）見表4。

2.9?回收率實(shí)驗(yàn)

取各真菌毒素貯備液配制成混標(biāo)（混標(biāo)濃度根據(jù)26種毒素的定量限擴(kuò)大25倍進(jìn)行配制），分別以1倍、5倍和25倍定量限作為添加濃度進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，分別在一天和連續(xù)的5 d進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，26種生物毒素的平均回收率范圍為80.1%～116.2%，RSD范圍為0.2%～6.6%。見表4。

2.10?樣品測定結(jié)果

采用建立的UHPLC-MS/MS方法對36份三七樣品進(jìn)行分析，樣品測定結(jié)果見表5。

3?討論

3.1?檢測真菌毒素種類的選擇

目標(biāo)真菌毒素均為毒性大，食品和飼料中污染面廣，關(guān)注度高的真菌毒素。黃曲霉類毒素是目前發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的一類真菌毒素，具有強(qiáng)烈的致癌性，不僅造成嚴(yán)重的肝損傷，引發(fā)肝癌以外，也被發(fā)現(xiàn)會誘導(dǎo)腎癌、胰腺癌和結(jié)腸癌的產(chǎn)生[15]。赭曲霉類毒素具有多種慢性毒性，如致癌性、生長生殖毒性、神經(jīng)毒性及免疫毒性等[16]。玉米赤霉烯酮類毒素最主要的毒性是生長生殖毒性，長期大劑量下攝入會致癌，并具有相對突出的免疫毒性[17]。同樣，T-2毒素、HT-2毒素、伏馬類毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇都是受到廣泛關(guān)注的真菌毒素[18-20]，糧谷中污染情況嚴(yán)重，國內(nèi)外食品、藥品法規(guī)都相繼增加了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)限度。桔青霉素急性毒性屬于高毒[21]，恩鐮孢菌素為近年來研究熱點(diǎn)，飼料中普遍檢出[2]。

3.2?色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

目標(biāo)真菌毒素種類不同，理化性質(zhì)差異較大，三七基質(zhì)干擾不同。通過對每種真菌毒素通過質(zhì)譜全掃描確定了采集模式，并通過比較2種模式下基質(zhì)干擾情況，確定6種玉米赤霉烯酮類真菌毒素在負(fù)模式下采集，其他20種真菌毒素均在正離子模式下采集。

流動相系統(tǒng)比較了甲醇和乙腈2種有機(jī)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示正離子模式下，甲醇系統(tǒng)中的基質(zhì)干擾分離度優(yōu)于乙腈系統(tǒng)，最終選擇甲醇作為正離子掃描模式流動相。為了改善離子化效率，提高分析靈敏度，比較了甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨等改性劑，結(jié)果乙酸和乙酸銨表現(xiàn)不如甲酸和甲酸銨，而甲酸銨在較高濃度下（5 mmol/L）出現(xiàn)抑制離子化效率的現(xiàn)象。經(jīng)試驗(yàn)，在添加0.5%甲酸和2 mmol/L甲酸銨的情況下，甲酸用于提高電噴霧正模式下部分真菌毒素的離子化效率，添加甲酸銨可以改善峰形，抑制質(zhì)譜電離中[M+K]+和[M+Na]+峰，獲得了最好的分離效果。在負(fù)離子模式下，采用乙腈流動相能改善峰形，在保證滿意的分離度前提下，縮短洗脫時間。最終，正離子模式下選擇0.5%甲酸，2 mmol/L甲酸銨水溶液及甲醇溶液作為流動相;負(fù)離子模式下，選擇水和乙腈作為流動相。

由于三七基質(zhì)中存在較多皂苷類等大極性的干擾物質(zhì)，梯度洗脫中先采用較大比例的水進(jìn)行雜質(zhì)干擾的去除，同時為保護(hù)質(zhì)譜進(jìn)樣環(huán)境，進(jìn)樣前2分鐘采用廢液切換模式。

3.3?前處理?xiàng)l件優(yōu)化

由于為痕量分析且同時分析多種不同種類的真菌毒素，需要完全提取真菌毒素同時盡量減少基質(zhì)干擾，以達(dá)到準(zhǔn)確分析的目的，需對前處理過程中的提取效率、凈化干擾雜質(zhì)進(jìn)行重點(diǎn)優(yōu)化。QuEChERS方法是一種新型的通用型前處理方法，2003年發(fā)表運(yùn)用在多種農(nóng)藥殘留檢測前處理方法，該方法具有快速、簡便、廉價、有效、耐用、安全以及回收率高的優(yōu)點(diǎn)，可作為高通量真菌毒素檢測的前處理方法[22-24]。對提取和凈化操作中的提取方式、提取溶劑、凈化填料的組合和配比進(jìn)行改良和優(yōu)化。

3.3.1?提取方式?常規(guī)提取方式有超聲提取法、液液萃取法及震蕩提取法等，由于真菌毒素污染可同時出現(xiàn)在藥材表面與內(nèi)部，研究中采用了勻漿法提取，可快速達(dá)到完全提取的目的。

3.3.2?提取溶劑優(yōu)化

比較了乙腈和甲醇2種通用型提取溶劑，甲醇相對于乙腈具有較好的溶解度，而乙腈具有更好的選擇性，可以避免提取更多脂肪、色素等雜質(zhì)，且乙腈的提取效率更好，因采用乙腈作為提取溶劑。

待測真菌毒素中伏馬菌素類、桔青霉素、赭曲霉毒素類等毒素具有羧基集團(tuán)，水溶性強(qiáng)，對酸敏感性。常規(guī)乙腈水系統(tǒng)提取條件下，上述真菌毒素的回收率低于10%。故提取溶劑采用加入甲酸的方式，提高其穩(wěn)定性，增加提取效率。通過對加入甲酸的濃度進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示隨著乙腈溶劑中甲酸濃度的提高，能夠使赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B和伏馬菌素回收率逐漸上升，說明提取溶劑酸度對于酸敏感性毒素的提取效率影響大，經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)15%甲酸乙腈為最合適比例，各毒素的回收率均達(dá)到80%以上。

3.3.3?凈化填料優(yōu)化

QuEChERS法常用凈化填料包括：十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳碳黑（GCB）和中性氧化鋁等?？疾熘邪l(fā)現(xiàn)中性氧化鋁對改善回收率無明顯影響。根據(jù)三七基質(zhì)特點(diǎn)，本次研究中選擇PSA、GCB、MgSO4、C18作為凈化材料。經(jīng)試驗(yàn)，GCB雖有助于除去較多的色素，但其特殊的平面結(jié)構(gòu)對玉米赤霉烯酮類毒素回收率影響大，故減小其使用量。考察發(fā)現(xiàn)C18量不足或者過量時，HT-2，OTA及OTB的回收率為30%～60%;而PSA有助于除去脂肪酸等雜質(zhì)，但過多PSA會對FB1、FB2以及FB3的回收率有一定的影響，確定PSA的最佳使用量均為150 mg，最終優(yōu)化得到的填料配比為：GCB 30 mg，PSA150 mg，C18 300 mg，MgSO4 900 mg時，各真菌回收率均達(dá)到80%以上。

3.3?回收率與精密度?目標(biāo)真菌毒素回收全部滿足80%～120%，相對偏低的主要為伏馬菌素類，在中、高濃度下的回收率相比低濃度下偏低，但仍達(dá)到80%以上。

3.4?基質(zhì)效應(yīng)?對樣品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察：比較真菌毒素的基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇┡渲频幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，基質(zhì)效應(yīng)（%）=[（基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）-1]×100%。結(jié)果顯示大部分真菌毒素為基質(zhì)抑制效應(yīng)，少數(shù)真菌毒素如伏馬菌素類呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。部分毒素的基質(zhì)效應(yīng)可達(dá)50%～80%。說明基質(zhì)干擾明顯，主要是QuEChERS前處理為通用型前處理，雖能將目標(biāo)真菌毒素全部提取，但同時提取的干擾物也非常多，盡管采用了混合填料凈化，但因?yàn)檎婢舅睾康?，基質(zhì)干擾仍較為明顯，因此必須采用基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

伏馬菌素類基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)的原因可能是與真菌毒素共流出物中含有質(zhì)子供體化合物，使得該類毒素均為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

3.5?三七檢測結(jié)果分析

2個省份種植基地生產(chǎn)的36批三七樣品中僅有3批樣品分別檢出恩鐮孢菌素B、B1和伏馬菌素B2，且檢出量均較低，約為1 μg/kg。美國2001年頒布的《工業(yè)指南：人類食物和動物飼料中伏馬菌素限值》規(guī)定玉米粉中伏馬菌素的限度為2 000 μg/kg，歐盟頒布的食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)（EC）No.1881/2006中規(guī)定伏馬菌素的限度為1 000 μg/kg。與該限度比較，三七中檢出的伏馬菌素B2遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于參考限度。

有關(guān)恩鐮孢菌素B、B1的毒性研究目前尚不成熟，目前研究發(fā)現(xiàn)是恩鐮孢菌素具有細(xì)胞毒性;但需要但同時也發(fā)現(xiàn)恩鐮孢菌素具有殺菌抗炎的功效，一定程度上屬于抗菌素和抗生素[25-27]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明ENNB體外對肝細(xì)胞毒性大[29-30]，但仍需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。因此目前尚不能說明三七檢出恩鐮孢菌素B、B1是否具有一定的風(fēng)險。待將來恩鐮孢菌素毒性研究深入后再進(jìn)一步評價。

本次研究采用改良QuEChERS前處理技術(shù)，建立了UHPLC-MS/MS同時檢測三七中26種真菌毒素的方法?？煽焖偻瓿芍兴幦咧?6種常見真菌毒素的定性和定量分析，具有操作簡單、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，也為其他中藥基質(zhì)中多種真菌毒素含量的同時檢測提供技術(shù)借鑒。

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