4 Gy60Co γ射線對Balb/c小鼠睪丸輻射損傷效應(yīng)的研究

王磊　石中玉　王安　王艷　李盼飛　盧曦　張淑靜　高譽珊　胡素敏

〔摘要〕 目的 探討4 Gy60Co γ射線對Balb/c小鼠睪丸的輻射損傷效應(yīng)。方法 將60只Balb/c小鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機數(shù)表法分為正常組和輻射組，每組30只。對輻射組小鼠給予4 Gy60Co γ射線一次性全身照射，并分別在照后14、21、35 d取材，檢測小鼠睪丸指數(shù)，睪丸病理變化，精子濃度、活率、活力、正常形態(tài)率、血清激素等指標。結(jié)果 與正常組比較，輻射組小鼠睪丸指數(shù)在照后14、21、35 d時均顯著降低（P<0.001）;輻射后14 d時，輻射組小鼠精子濃度、精子活率、活力以及正常精子形態(tài)率均無顯著性差異，而小鼠血清睪酮顯著升高（P<0.05）;輻射后21 d時，輻射組小鼠精子濃度、精子活率和精子活力以及正常精子形態(tài)百分比均顯著降低（P<0.01）;照后35 d時，輻射組小鼠精子濃度、精子活率、精子活力以及正常精子形態(tài)百分比均顯著降低（P<0.001）;4 Gy60Co γ射線對小鼠血清黃體激素和促卵泡素的影響不顯著（P>0.05）。結(jié)論 4 Gy60Co γ射線對Babl/c小鼠睪丸損傷嚴重。

〔關(guān)鍵詞〕 60Co γ射線;輻射損傷;電離輻射;睪丸;精子

〔中圖分類號〕R818.74? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.008

Study on Radiation Injury of 4 Gy60Co γ Ray to Testis of Balb/c Mice

WANG Lei， SHI Zhongyu， WANG An， WANG Yan， LI Panfei， LU Xi， ZHANG Shujing， GAO Yushan， HU Sumin*

（School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese medicine， Beijing 100029， China）

〔Abstract〕 Objective To study the radiation injury of 4 Gy60Co γ ray on testis of Balb/c mice. Methods A total of 60 Balb/c mice were randomly divided into the normal group and the radiation group according body weight through random number table， with 30 mice in each group. The radiation group was given whole-body exposure to 4 Gy60Co γ ray. On the 14th， 21st， 35th day of exposure， the materials were taken to detect the testicular index， pathological changes of testis， sperm concentration， sperm motility， sperm activity， normal sperm forms， serum hormone and other indicators. Results Compared with the normal group， the testicular index of irradiated-mice decreased significantly on 14th day， 21th day and 35th day （P<0.001）; There was no significant difference in sperm concentration， sperm viability， sperm motility of mice and percentage of normal sperm morphology in the radiation group on 14th day and the normal group， while the level of serum testosterone in mice increased significantly （P<0.05）. After 21 days of radiation， the sperm concentration， sperm viability， sperm motility of mice and percentage of normal sperm morphology of the mice in the radiation group decreased significantly （P<0.01）. The effect of 4 Gy60Co γ ray on serum LH and FSH was not significant （P>0.05）. Conclusion 4 Gy60Co γ ray can cause severe damage to the testis of Balb/c mice.

〔Keywords〕 60Co γ ray; radiation damage; ionizing radiation; testicle; semen

睪丸是產(chǎn)生精子和分泌雄性激素的器官。其中精子產(chǎn)生于生精小管內(nèi)，而雄激素主要由間質(zhì)細胞合成和分泌[1]，雄激素能促進精子發(fā)生和男性生殖器官的正常發(fā)育，并維持男性的第二性征和性功能。同時睪丸是一個輻射敏感器官，極易遭受電離輻射的損傷，以致生精功能障礙，更有甚者可致永久不育。本文主要探討電離輻射對小鼠睪丸的損傷效應(yīng)，為揭示急性電離輻射致小鼠睪丸損傷的機制提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1? 實驗動物及分組

雄性Balb/c小鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（20±2） g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。所有Balb/c小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物房，飼養(yǎng)溫度（23±2） ℃，濕度40%～60%，12 h交替光照模擬晝夜時間，自由飲食。將小鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機數(shù)表法分為正常（NC）組和輻射（IR）組，每組30只。每組將30只小鼠根據(jù)取材時間點的不同，分成3批，每批10只。

1.2? 儀器與試劑

Olympus BX51顯微鏡，日本Olympus;WLYI-90000計算機生殖輔助系統(tǒng)，北京偉力新世紀公司。促卵泡素（follicle stimulating hormone， FSH）檢測試劑盒：北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，批號：CEA830Mu。黃體激素（luteinizing hormone， LH）檢測試劑盒：北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，批號：CEA441Mu。睪酮（testosterone， T）檢測試劑盒：北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，批號：CEA458Ge。

2 方法

2.1? 動物造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，對輻射組小鼠進行一次性全身60Co γ射線照射，劑量為4.0 Gy，劑量率為0.55 Gy/min，照射地點為北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院鈷源實驗室;正常組小鼠不接受輻射。

2.2? 動物取材

各組小鼠分別于輻射后第14、21、35天分3批，每批10只，眼眶取血后斷頸處死，檢測以下各項指標。

2.3? 檢測指標

2.3.1? 睪丸指數(shù)? 小鼠斷頸處死后，取雙側(cè)睪丸，稱其質(zhì)量，計算睪丸指數(shù)。

睪丸指數(shù)=睪丸質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

2.3.2? 精子質(zhì)量檢測? （1）小鼠脫頸椎處死后，將雙側(cè)附睪組織分離，并移入盛有1 mL Medium199培養(yǎng)液的小培養(yǎng)皿中，將附睪用眼科剪剪碎，并用移液器吹打均勻，使附睪中的精子充分游離，制成精子懸液。室溫下，用移液槍吸取10 μL精子懸液滴于血球計數(shù)板上計數(shù)，并換算成精子相對濃度進行比較。（2）室溫下，取10 μL精子懸液滴于血球計數(shù)板上，光鏡下檢測精子活率和活力，檢測時間控制在10 min以內(nèi)，精子活動分為四級：a級精子指快速前向運動的精子，b級精子指緩慢或呆滯的前向運動的精子，c級精子指非前向運動的精子，d級精子指不動的精子。精子活力：樣品中（a級+b級）精子占精子總數(shù)的百分率。精子活率：樣品中（a級+b級+c級）精子占精子總數(shù)的百分率。（3）將（1）中剩余的精子懸液加入適量的1%伊紅溶液，染色20 min后，取1滴于潔凈玻片，均勻推片，空氣中自然干燥，用中性樹脂封片，制成精液樣本片。在400、800倍顯微鏡下觀察精子形態(tài)，記錄畸形精子的數(shù)量，計算畸形率。精子畸形大致可分為卷曲、大頭、雙頭、雙尾、無鉤、香蕉形等。有頭無尾、輪廓不清、重疊和明顯被剪碎的精子不計[2]。

精子畸形率=畸形精子數(shù)/檢查的精子數(shù)×100%。

2.3.3? 小鼠睪丸組織HE染色? 取小鼠一側(cè)的睪丸，以改良的Davidson’s固定液（37%～40%甲醛溶液∶無水乙醇∶冰醋酸∶去離子水按6∶3∶1∶10的比例配制）固定24 h后轉(zhuǎn)移至10%中性甲醛溶液中保存。酒精梯度脫水后用石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.3.4? ELISA法測定小鼠血清中激素? 小鼠眼眶取血，靜置2 h，然后在3 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，分離上層血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清中的LH、FSH和T。

2.4? 統(tǒng)計方法

實驗結(jié)果以“x±s”進行統(tǒng)計描述，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。組間比較用獨立樣本的t檢驗，所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 4 Gy60Co γ射線對小鼠睪丸指數(shù)的影響

與正常組比較，輻射組小鼠在照后7 d、21 d和35 d的睪丸指數(shù)均顯著降低（P<0.001）。與照后14 d輻射組小鼠比較，照后21 d和35 d輻射組小鼠睪丸指數(shù)均顯著降低（P<0.001）;而照后35 d和21 d的輻射組間比較，兩組小鼠睪丸指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

3.2? 4 Gy60Co γ射線對小鼠精子濃度和質(zhì)量的影響

3.2.1? 精子濃度? 與正常組相比，照后14 d輻射組小鼠精子濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;照后21 d和35 d時，輻射組小鼠精子濃度顯著降低（P<0.01，P<0.001）;照后35 d與照后21 d的輻射組比較，其精子濃度也顯著降低（P<0.001），見圖2A。

3.2.2? 精子活率? 與正常組相比，照后14 d時，輻射組小鼠精子活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;照后21 d時，輻射組小鼠精子活率顯著降低（P<0.01），較照后14 d輻射組小鼠精子活率也顯著降低（P<0.01）;照后35 d時，輻射組小鼠精子活率趨近于0，與正常組、照后14 d和照后35 d的輻射組比較，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見圖2B。

3.2.3? 精子活力? 和正常組相比，照后14 d時，輻射組小鼠精子活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;照后21 d時，輻射組小鼠精子活力顯著下降（P<0.01）。與照后14 d輻射組小鼠相比，照后21 d輻射組小鼠精子活力顯著降低（P<0.05）。照后35 d時，輻射組小鼠無精子活力，與正常組、照后14 d和照后35 d的輻射組比較，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見圖2C。

3.2.4? 精子形態(tài)? 與正常組相比，照后14 d時，輻射組小鼠正常形態(tài)精子百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;照后21 d時，輻射組小鼠正常形態(tài)精子百分比顯著降低（P<0.01）;照后35 d，輻射組小鼠正常形態(tài)精子百分比顯著下降（P<0.001），與照后14 d、21 d輻射組比較，正常形態(tài)精子百分率也顯著降低（P<0.01，P<0.05），見圖2D。

3.3? 4 Gy60Co γ射線對小鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

顯微鏡下觀察，在正常組小鼠睪丸中，生精小管結(jié)構(gòu)完好，排列緊密且規(guī)則。在生精小管中，支持細胞以及各級生精細胞排列整齊，生精上皮的基底膜結(jié)構(gòu)完整;各生精小管之間的排列正常，睪丸間質(zhì)完整;生精小管腔內(nèi)充滿長形精子。

隨著時間的推進，輻射組小鼠睪丸受到不同程度的損傷。照射后14 d，輻射組小鼠生精小管結(jié)構(gòu)比較完整，管腔內(nèi)生精細胞排列較為紊亂，層數(shù)減少，其中大部分精原細胞已觀察不到，但是精母細胞、精子細胞和長形精子胞等仍可見，生精小管明顯萎縮，生精小管之間的間隙增大;照后21 d，輻射組小鼠睪丸生精小管結(jié)構(gòu)混亂，精原細胞幾近消失，精母細胞、精子細胞脫落情況嚴重，生精上皮分層減少，生精小管高度退化、萎縮，管腔明顯縮小;照后35 d，輻射組小鼠生精小管基底膜出現(xiàn)破損，生精上皮呈現(xiàn)大量空泡樣結(jié)構(gòu)，支持細胞和間質(zhì)細胞萎縮退化，生精細胞嚴重脫落，生精小管腔嚴重萎縮，各生精小管之間的間隙增大，見圖3。

3.4? 4 Gy60Co γ射線照射對小鼠血清激素水平的影響

與正常組比較，照后14 d，輻射組小鼠血清睪酮含量顯著升高（P<0.01），照后21 d和35 d，輻射組間睪酮水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖4A;照后輻射組血清促卵泡素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖4B;照后21 d輻射組小鼠血清促黃體素水平顯著降低（P<0.05），照后14 d和35 d時，正常組和輻射組小鼠血清LH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖4C。

4 討論

睪丸對電離輻射非常敏感，較小劑量的電離輻射即可導(dǎo)致睪丸生精小管上皮、附睪上皮等出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，以致睪丸的生精過程被破壞。有研究發(fā)現(xiàn)1 Gy劑量的X射線全身照射小鼠，照后16 h即可觀察到小鼠生精細胞出現(xiàn)損傷[3];照射后4周，小鼠睪丸損傷較照后16 h加重，小鼠生精小管上皮變薄，生精細胞層數(shù)減少，管腔內(nèi)的成熟精子減少，生精小管的形狀發(fā)生不規(guī)則變化，管腔之間的間隙增大。可以觀察到，隨著照后時間的推移，電離輻射造成的小鼠睪丸的損傷也隨之加重。因為睪丸體積98%由生精小管等生發(fā)組織構(gòu)成[4]，所以睪丸體積減小及質(zhì)量降低的直接原因之一是生精小管等組織的萎縮退化。實驗發(fā)現(xiàn)，4 Gy60Co γ射線照射后，小鼠睪丸指數(shù)顯著降低，提示輻射導(dǎo)致小鼠睪丸的質(zhì)量減輕;在照后第14天時輻射組小鼠精原細胞大部分消失，精母細胞和精子細胞的損傷也較為嚴重，輻射組小鼠出現(xiàn)了生精細胞脫落壞死，生精上皮退化、變性、結(jié)構(gòu)破損，生精小管萎縮退化等一系列嚴重損傷，并且輻射組小鼠睪丸在輻射后21 d比14 d損傷嚴重，而輻射后35 d又比21 d損傷嚴重，提示隨著時間推移，電離輻射造成的小鼠睪丸的損傷也在持續(xù)性加重。

各輻射組小鼠的精子濃度在輻射后14 d時與正常組小鼠比較均無顯著性差異。可能是因為精子的輻射抗性較強，輻射后14 d時精子濃度沒有出現(xiàn)明顯的下降。但是在照后21 d時，輻射組小鼠的精子濃度顯著下降，并且在35 d時繼續(xù)下降。這是因為4 Gy劑量的電離輻射導(dǎo)致精原細胞大量死亡，且在1個生精周期（約35 d）內(nèi)無法恢復(fù)，小鼠精子發(fā)生過程被破壞，因此小鼠精子濃度持續(xù)降低。

有研究發(fā)現(xiàn)小鼠接受0.5 Gy以上劑量照射即可導(dǎo)致精子的活率和活力降低[5]，實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，輻射組小鼠精子活率和精子活力在輻射后14 d時無明顯變化，在照后21 d時顯著降低，照后35 d時幾乎喪失精子活率、活力。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)長期暴露于低劑量電離輻射后，會出現(xiàn)精子活力下降，但精子濃度未出現(xiàn)顯著變化的情況[6]，照后35 d的結(jié)果顯示，輻射組小鼠喪失精子活力和活率時，小鼠精子濃度還未降至0。

精子常見的畸形包括大頭、小頭、雙頭、無頭等，但正常男性的精液中也含有一定比例的畸形精子[7]，但電離輻射可導(dǎo)致正常精子形態(tài)發(fā)生改變。高劑量的電離輻射可以破壞精子的正常結(jié)構(gòu)，增加精子的畸形率[8]。實驗結(jié)果表明4 Gy射線對小鼠精子形態(tài)造成了嚴重損傷，提示小鼠的生育力可能受到影響。

精子的發(fā)生受眾多激素的調(diào)控，其中，電離輻射可導(dǎo)致激素水平發(fā)生變化，進而可能引起生精過程的異常。T是由Leydig細胞分泌的。與生精細胞相比，Leydig細胞具有較強的抗輻射能力，有研究發(fā)現(xiàn)，在受到輻射劑量≤5 Gy時，Leydig分泌T的功能受到一定的影響，但其細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯變化[9]，還有研究發(fā)現(xiàn)2 Gy的X射線照射能夠使小鼠T水平升高[10]，本實驗觀察到輻射組小鼠T在照后14 d時較正常組升高，與文獻報道一致。FSH和LH由垂體分泌，垂體同樣具有較強的抗輻射能力，實驗發(fā)現(xiàn)FSH的分泌水平未受電離輻射顯著影響;促性腺激素釋放素（GnRH）的脈沖式分泌可引起LH不連續(xù)釋放[1]，因此照后21 d時，正常組小鼠LH水平異常升高可能與之有關(guān)。

綜上，4 Gy60Co γ射線可以嚴重損傷睪丸結(jié)構(gòu)和功能，造成小鼠睪丸指數(shù)降低，生精小管萎縮退化、生精上皮結(jié)構(gòu)破壞嚴重，引起精子濃度降低，精子活率和活動力下降以及精子畸形率的升高。同時電離輻射上調(diào)了照后14 d小鼠T水平，但對FSH和LH的影響較小。急性輻射致小鼠睪丸損傷的機制仍有待進一步研究。

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