花楸花粉超低溫保存及再生

于琦 楊雨荷 劉歡 鄭昕雨 孔繁秋 張?，?宋紅

摘 要：【目的】探討花楸（Sorbus pohuashanensis）花粉超低溫保存及再生的方法，以延長(zhǎng)其花粉保存時(shí)間，為科研、生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐依據(jù)?！痉椒ā糠謩e設(shè)置不同培養(yǎng)基配方、不同光照、不同采集時(shí)間處理，進(jìn)行花楸花粉離體萌發(fā)試驗(yàn)，測(cè)定各試驗(yàn)處理的花粉萌發(fā)率;設(shè)置不同冷凍方式和化凍方式處理，測(cè)定兩種方式不同處理的花粉萌發(fā)率;制備不同含水率的花粉，分別測(cè)定其在超低溫保存前、后的萌發(fā)率?！窘Y(jié)果】（1）培養(yǎng)基為100 g·L-1蔗糖+100 mg·L-1硼酸的處理，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)72.42%;（2）黑暗處理花粉萌發(fā)率為77.24%，比光照處理高8.96個(gè)百分點(diǎn);（3）一天中，10∶00和14∶00采集的花粉，其活力顯著高于其他時(shí)間采集的花粉;（4）-20℃預(yù)冷凍培養(yǎng)30 min后投入液氮保存24 h的處理效果最好，花粉萌發(fā)率達(dá)43.15%;（5）超低溫保存后40℃水浴解凍5 min處理比其他解凍方式處理的花粉活力高，萌發(fā)率為35.70%;（6）花楸花粉超低溫保存最適含水率為7.72%，此含水率下花粉超低溫保存后萌發(fā)率最高，為31.53%。【結(jié)論】花楸花粉采用超低溫技術(shù)保存24 h后仍具有活力，黑暗條件、花粉采集時(shí)間、花粉萌發(fā)培養(yǎng)基、花粉含水率、冷凍與化凍方式均會(huì)對(duì)花楸花粉超低溫保存效果產(chǎn)生顯著影響。

關(guān)鍵詞：花楸;花粉;超低溫保存;種質(zhì)資源保護(hù)

中圖分類號(hào)：S 686文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）04-409-07

Abstract： 【Objective】Cryopreservation and regeneration of pollens of Sorbus pohuashanensis were investigatied. 【Method】 An in vitro method was developed with experiments on medium formulation， light exposure， and pollen collection for the pollen germination rate determination.The germination rates of? S.pohuashanensis pollens treated by various freezing and thawing procedures? and different moisture contents before and after the treatments were compared. 【Result】（1） The medium for optimum pollen germination was found to consist of? sucrose 100 g·L-1 and? boric acid 100 mg·L-1 that delivered a rate of 72.42%. （2） Incubation in darkness yielded a germination rate of 77.24%， which was 8.96 percentage point higher than that under light exposure. （3） The vitality of pollens collected at 10 a.m. or 2 p.m. was significantly higher than other time in a day. （4） Among all cryopreservation methods tested， pre-freezing pollens at -20℃ for 30 min prior to submerging in liquid nitrogen for 24 h provided the greatest germination rate of 43.15% after thawing. （5） For thawing， soaking the frozen pollens in a 40℃ water bath for 5 min rendered the highest germination rate of 35.70%. （6） Moisture content of the pollens for the cryopreservation was determined to be 7.72% to result in the best germination rate of 31.53% after thawing. 【Conclusion】The cryopreservation conditions for S. pohuashanensis pollens as established would result in high viability and germination rate after storage.

Key words： Sorbus pohuashanensis; pollen; cryopreservation; germplasm preservation

0 引言

【研究意義】植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)是指在液氮（-196℃）的超低溫條件下將植物的器官進(jìn)行保存，如此低溫條件下，植物材料中與細(xì)胞生長(zhǎng)代謝有關(guān)的各種生物酶的活性受到極大抑制，生物體新陳代謝活動(dòng)基本停止，處于“生機(jī)停頓”狀態(tài)，從而可以延長(zhǎng)植物材料保存時(shí)間，理論上實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源的永久保存[1]。對(duì)于具有良好觀賞價(jià)值、食用價(jià)值和藥用價(jià)值的花楸來說，研究探討其花粉的超低溫保存及再生的最佳方式方法具有重要意義。花粉是育種的重要材料和植物種質(zhì)的重要形式，采用超低溫保存方法可以延長(zhǎng)花粉保持生活力的時(shí)間，從而克服花期不遇、地理分隔等困難，為雜交育種，單倍體育種奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)新品種培育;同時(shí)，實(shí)現(xiàn)花粉超低溫保存可為其種質(zhì)資源的保存和交換提供更經(jīng)濟(jì)便捷的方式?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)外較早開展花粉超低溫保存的研究，1922年Knowlton最早報(bào)道了金魚草花粉經(jīng)-180℃貯存后仍有活力[2]。20世紀(jì)80年代，花粉超低溫保存在我國(guó)日漸興起。目前，花粉超低溫保存技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和園林植物等，如牡丹、丁香、山茶和桃葉衛(wèi)矛[3-6]等園林植物均已成功進(jìn)行了花粉的超低溫保存?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于超低溫保存花粉的效果因植物材料的不同有很大的差異，而有關(guān)花楸花粉超低溫保存方面的研究未見報(bào)道，本研究從影響花粉超低溫保存效果的主要因素入手，以花粉萌發(fā)培養(yǎng)基、花粉日活力最高時(shí)間，以及進(jìn)行超低溫保存的花粉最佳含水率、預(yù)冷凍方式與化凍方式為切入點(diǎn)，進(jìn)行上述各主要影響因素的單因素試驗(yàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確花楸花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，光照對(duì)花粉萌發(fā)的影響，花粉日活力最高的時(shí)間，以及進(jìn)行花粉超低溫保存的最佳預(yù)冷凍方式、化凍方式與花粉最佳含水率，提出花楸花粉超低溫保存的最佳方式方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花楸花粉采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，于2018年5月花楸花期內(nèi)選擇晴朗的天氣，直接采集花朵，置于硫酸紙袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)抖落花藥上的花粉，完成對(duì)花粉的收集。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉生活力測(cè)定方法

花粉培養(yǎng)采用懸滴萌發(fā)法[7]。將花粉放入25℃人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后取出，于電子顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率?；ǚ酃荛L(zhǎng)度超過花粉直徑2倍記為花粉萌發(fā)。視野內(nèi)花粉萌發(fā)率=視野內(nèi)花粉萌發(fā)數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù)。每次隨機(jī)選取5個(gè)視野，視野內(nèi)花粉萌發(fā)率的平均值為該次測(cè)定花粉的萌發(fā)率。

1.2.2 花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)

進(jìn)行不同質(zhì)量濃度的蔗糖與硼酸二因素交叉試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)蔗糖質(zhì)量濃度梯度為50、100、150、200 g·L-1，硼酸質(zhì)量濃度梯度為100、150、200 mg·L-1，組合為12個(gè)培養(yǎng)基配方處理，3次重復(fù)，即每個(gè)處理觀測(cè)3個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

1.2.3 光照對(duì)花粉萌發(fā)力的影響試驗(yàn)

設(shè)置黑暗和光照兩個(gè)處理。以在盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿外面包裹錫紙為黑暗處理，不包錫紙為光照處理。均放入25℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。每組重復(fù)3個(gè)試驗(yàn)，觀察及統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率同1.2.2。

1.2.4 花粉日活力的測(cè)定

選擇晴朗天氣，一天內(nèi)分別于8∶00、10∶00、12∶00、14∶00、16∶00采集花粉，測(cè)定不同采集時(shí)間的花粉萌發(fā)率。

1.2.5 花粉預(yù)冷凍處理試驗(yàn)

將新鮮花粉裝入1.8 mL冷凍管中，設(shè)置5個(gè)處理，即：不經(jīng)預(yù)冷凍（CK）;-4℃恒溫預(yù)冷凍30 min;-20℃恒溫預(yù)冷凍30 min;-80℃恒溫預(yù)冷凍30 min;逐級(jí)變溫預(yù)冷凍（-4℃、30 min→-20℃、30 min→-80℃、30 min），然后均立即投入液氮里儲(chǔ)存24 h。

此時(shí)間設(shè)置的依據(jù)是：花粉超低溫保存24 h后，時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)花粉活力無顯著影響[4，8-9]?；瘍龊蠓謩e測(cè)定其花粉萌發(fā)率。

1.2.6 花粉化凍方式試驗(yàn)

新鮮花粉從上述液氮中保存24 h后取出，分別用自來水化凍5 min，40℃水浴化凍2 min，25℃室溫下化凍30 min，測(cè)定3種化凍方式的花粉萌發(fā)率。

1.2.7 不同含水率花粉的超低溫保存試驗(yàn)

采用烘干法測(cè)定花粉初始含水量M0[10]。

采用硅膠干燥法制備不同含水率的花粉。稱量新鮮花粉的質(zhì)量（Ma），裝入1.8 mL干燥管后稱量總質(zhì)量（Mb），將盛有新鮮花粉的干燥管放入硅膠干燥器中干燥一段時(shí)間后稱量質(zhì)量記為Mc。

利用上述方法將新鮮花粉分別干燥2.5、5.0、7.5 h，得到含水率分別為9.94%、7.72%、4.84%的花粉。分別測(cè)定不同含水率花粉投入液氮冷凍前的萌發(fā)率和投入液氮保存24 h后的萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)花粉萌發(fā)力的影響

由圖1可知，花粉萌發(fā)率在不同培養(yǎng)基處理間差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。當(dāng)硼酸質(zhì)量濃度固定在100 mg·L-1時(shí)，花粉萌發(fā)率隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，呈現(xiàn)先顯著增加后顯著減小的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在蔗糖質(zhì)量濃度為100 g·L-1時(shí)，其萌發(fā)率達(dá)72.42%;當(dāng)硼酸質(zhì)量濃度固定在150 mg·L-1時(shí)，花粉萌發(fā)率隨蔗糖質(zhì)量濃度的增加，也是呈現(xiàn)先顯著增加后顯著減小的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在蔗糖質(zhì)量濃度150 g·L-1時(shí)，其萌發(fā)率達(dá)53.65%;當(dāng)硼酸質(zhì)量濃度固定在200 mg·L-1時(shí)，花粉萌發(fā)率隨蔗糖質(zhì)量濃度增加而顯著下降，最高值出現(xiàn)在蔗糖質(zhì)量濃度50 g·L-1時(shí)，其萌發(fā)率為36.96%。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度固定在50 g·L-1時(shí)，硼酸質(zhì)量濃度的改變對(duì)花粉萌發(fā)率沒有顯著影響，其萌發(fā)率在36.95%～42.63%;其他3個(gè)蔗糖質(zhì)量濃度處理（100、150、200 g·L-1），均表現(xiàn)為隨著硼酸質(zhì)量濃度的改變，花粉萌發(fā)率都顯著改變，但變化趨勢(shì)并不相同?？梢?，在雙因素試驗(yàn)中，其中一個(gè)因素質(zhì)量濃度的改變，其花粉萌發(fā)率并未表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，說明一個(gè)因子對(duì)花粉萌發(fā)是發(fā)揮促進(jìn)作用或抑制作用是由另一個(gè)因子決定的，培養(yǎng)基中的蔗糖和硼酸存在最佳質(zhì)量濃度配比的問題，本試驗(yàn)中花粉萌發(fā)率最高的處理組合是蔗糖100 g·L-1、硼酸100 mg·L-1處理，其花粉萌發(fā)率可達(dá)72.42%。

對(duì)花楸花粉在不同蔗糖和硼酸質(zhì)量濃度培養(yǎng)基上的萌發(fā)率進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，花粉的萌發(fā)率在蔗糖質(zhì)量濃度間、硼酸質(zhì)量濃度間、硼酸質(zhì)量濃度×蔗糖質(zhì)量濃度間均具有顯著性差異。在硼酸質(zhì)量濃度相同時(shí)，蔗糖質(zhì)量濃度200 g·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低;在蔗糖質(zhì)量濃度相同時(shí)，硼酸質(zhì)量濃度200 mg·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低?？梢?，硼酸或蔗糖的質(zhì)量濃度過高都會(huì)抑制花楸花粉的萌發(fā)。

2.2 光照對(duì)花粉萌發(fā)力的影響

由圖2可知，采集的花粉置于100 g·L-1蔗糖+100 mg·L-1硼酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在光照和黑暗兩種不同培養(yǎng)條件下花粉萌發(fā)率差異達(dá)顯著水平。光照處理的花粉萌發(fā)率為68.28%，黑暗處理的花粉萌發(fā)率為77.24%。說明黑暗條件更有利于花楸花粉的萌發(fā)。

2.3 花粉日活力變化

由圖3可知，同一天內(nèi)不同時(shí)間花楸花粉的萌發(fā)率不同。在10∶00和14∶00花粉萌發(fā)率達(dá)到一天中的兩個(gè)高峰，分別為66.70%和65.81%，12∶00花粉萌發(fā)率大幅下降，在14∶00達(dá)到一天中最高后急劇下降，在16∶00達(dá)到一天中最低的萌發(fā)率。經(jīng)過方差分析，10∶00與14∶00花粉萌發(fā)率差異不顯著，但二者與一天中其他時(shí)間花粉萌發(fā)率的差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）。觀測(cè)結(jié)果表明，花楸花粉在一天中活力最強(qiáng)的時(shí)間為10∶00和14∶00，此時(shí)采集的花粉萌發(fā)率最高。

2.4 預(yù)冷凍方式對(duì)花粉超低溫保存效果的影響

由圖4可知，不同預(yù)冷凍處理對(duì)花楸花粉超低溫保存效果的影響有顯著差異。以-20℃預(yù)冷凍30 min的花粉萌發(fā)率最高，達(dá)43.15%，與其他預(yù)冷凍方式比較差異顯著（P<0.05）。經(jīng)-80℃預(yù)冷凍30 min和不經(jīng)預(yù)冷凍直接投入液氮的花粉萌發(fā)率差異不顯著;-4℃預(yù)冷凍30 min處理的花粉萌發(fā)率最低，為15.04%，顯著低于其他處理。試驗(yàn)結(jié)果表明，花楸花粉經(jīng)-20℃預(yù)冷凍30 min的超低溫保存效果最好。

2.5 化凍方式對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

由圖5可知，不同化凍方式處理間的花粉萌發(fā)率差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）。以40℃水浴化凍2 min處理的萌發(fā)率最高，為35.70%，均顯著高于自來水化凍5 min和25℃室溫化凍30 min兩個(gè)處理。試驗(yàn)結(jié)果表明，花粉超低溫保存后40℃水浴化凍2 min效果最好，可作為下一步試驗(yàn)的依據(jù)。

2.6 不同含水率花粉超低溫保存前后的萌發(fā)率

由圖6可知，不同含水率的花楸花粉超低溫保存前后萌發(fā)率有所差異。冷凍前，含水率為12.63%、9.94%、7.72%的花粉萌發(fā)率差異不顯著，均高于25%，說明含水率在7.72%～12.63%時(shí)，含水率對(duì)冷凍前花粉的萌發(fā)率影響不大;但當(dāng)含水率降到4.86%時(shí)，無一花粉萌發(fā)。冷凍后，含水率較低的兩個(gè)處理（4.84%、7.72%）差異不顯著;當(dāng)含水率超過7.72%后，花粉萌發(fā)率會(huì)出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，花楸花粉含水率為7.72%為最適宜花粉萌發(fā)的含水率。

含水率為9.94%和12.63%的花粉在冷凍后萌發(fā)率均有所下降，且凍前凍后花粉萌發(fā)率差異顯著;而含水率為4.84%和7.72%的花粉在冷凍后萌發(fā)率均有所升高，其中含水率4.84%的花粉凍前凍后萌發(fā)率差異顯著，含水率7.72%的花粉凍前凍后萌發(fā)率差異不顯著。說明適宜的含水率不會(huì)造成花粉冷凍后萌發(fā)率的顯著改變。

3 討 論

蔗糖和硼酸對(duì)花粉管的萌發(fā)和伸長(zhǎng)具有重要作用。蔗糖作為花粉萌發(fā)的能源物質(zhì)，不僅起到提供能量的作用，還具有維持細(xì)胞滲透壓的作用[11]。硼酸可以與糖類物質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)花粉管對(duì)糖類物質(zhì)的利用[12]。適宜的蔗糖和硼酸配比對(duì)花粉萌發(fā)有顯著影響。本試驗(yàn)中不同蔗糖和硼酸配比處理的花粉萌發(fā)率差異顯著，在蔗糖100 g·L-1+硼酸100 mg·L-1培養(yǎng)基培養(yǎng)下的花粉萌發(fā)率最高，顯著高于其他處理。Brewbaker等[13]認(rèn)為，硼酸是花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的重要影響因子，對(duì)大多數(shù)物種來說最佳質(zhì)量濃度為100 mg·L-1，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。在蔗糖質(zhì)量濃度為50～150 g·L-1時(shí)，均以硼酸質(zhì)量濃度200 mg·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低;在硼酸質(zhì)量濃度50～200 mg·L-1時(shí)，均以蔗糖質(zhì)量濃度200 g·L-1的培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最低。究其原因，可能與培養(yǎng)基中蔗糖或硼酸質(zhì)量濃度過高，使花粉細(xì)胞失水，抑制了花粉的萌發(fā)有關(guān)。前人的研究表明，花粉萌發(fā)與蔗糖、硼酸、鈣、生物調(diào)節(jié)物質(zhì)及pH值等因素有關(guān)，在復(fù)雜配方的培養(yǎng)基中蔗糖、硼酸的配比還有待于進(jìn)一步的探究。

不同光照條件對(duì)不同植物花粉萌發(fā)率的影響不同。馬尾松在黑暗條件下的花粉萌發(fā)率高于光照條件，但未達(dá)到顯著差異水平[14];蒿柳在黑暗條件下的花粉萌發(fā)率顯著低于光照條件 [15];光照和黑暗對(duì)柳樹和桂花花粉萌發(fā)無顯著影響[16-17]。而本試驗(yàn)與以上結(jié)果均不同。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在黑暗條件下花楸花粉萌發(fā)率高于光照條件，且差異達(dá)顯著水平（P<0.05）?；ǚ鄣碾x體萌發(fā)是模擬花粉在花中的萌發(fā)環(huán)境，本試驗(yàn)結(jié)果可能與花粉萌發(fā)時(shí)花楸花的狀態(tài)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探究。

花粉在一天中不同時(shí)間的活力不同，而不同植物花粉日活力變化趨勢(shì)也不同。桂花花粉萌發(fā)率從8∶00到16∶00逐漸升高[18];甘蔗花粉一天中隨著時(shí)間推移花粉萌發(fā)率逐漸降低，13∶00時(shí)花粉完全喪失活力[19];亞洲百合和萬壽菊一天中花粉活力的變化為先升高后降低[20-21]。本試驗(yàn)中花楸花粉日活力的變化與上述植物的表現(xiàn)均不相同，花楸花粉活力在上午和下午分別呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別在10∶00和14∶00達(dá)到兩個(gè)峰值。一天中隨著時(shí)間的變化，溫度和光照強(qiáng)度也隨之變化。一定的溫度和光照強(qiáng)度可以促進(jìn)花粉的發(fā)育和成熟，10∶00和14∶00的光照強(qiáng)度和溫度可能最適宜花楸花粉的萌發(fā)，其花粉萌發(fā)率高;而12∶00的光照強(qiáng)度和溫度均過高，其花粉萌發(fā)率較其他時(shí)間段低。

花粉超低溫保存過程中預(yù)冷凍可以使細(xì)胞內(nèi)的自由水發(fā)生保護(hù)性脫水，進(jìn)行體外結(jié)冰，減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶，從而減少細(xì)胞受到冰晶機(jī)械損傷，同時(shí)預(yù)冷凍可以使細(xì)胞進(jìn)行抗寒鍛煉，提高耐寒性。預(yù)冷凍因植物材質(zhì)的不同所產(chǎn)生的效果也不同。在對(duì)百合花粉的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過-20℃預(yù)冷凍的花粉萌發(fā)率顯著高于室溫、0℃、-70℃的處理 [22];對(duì)甘藍(lán)型油菜的研究顯示，逐步降溫預(yù)冷凍處理對(duì)花粉形態(tài)和大小影響最小[9];馬鈴薯經(jīng)過逐級(jí)降溫預(yù)冷凍處理，花粉活力在超低溫保存后有所提高[23]。本試驗(yàn)中，對(duì)新鮮花粉分別設(shè)置5種預(yù)冷凍處理，-80℃預(yù)冷凍處理和不經(jīng)預(yù)冷凍處理的花粉超低溫保存后花粉萌發(fā)率相差甚微，說明對(duì)于花楸花粉，-80℃下的預(yù)冷凍沒有效果。逐級(jí)變溫預(yù)冷凍處理的花粉超低溫保存后花粉萌發(fā)率均顯著高于-4℃預(yù)冷凍處理、-80℃預(yù)冷凍處理和不經(jīng)預(yù)冷凍處理，但其花粉萌發(fā)率低于-20℃預(yù)冷凍處理的花粉，這表明花楸花粉在-20℃冷凍30 min的預(yù)冷凍方式最佳。這可能是由于花楸花粉在-20℃時(shí)，細(xì)胞膜的透性處于最適狀態(tài)，有利于細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性脫水，因而受到冰晶機(jī)械損傷程度最小，而-4℃和-80℃預(yù)冷凍處理因溫度過低或過高，均不利于細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性脫水。預(yù)冷凍對(duì)花粉超低溫保存后的效果與含水率有較大關(guān)系，花楸花粉含水率與預(yù)冷凍的效果的關(guān)系有待于進(jìn)一步探究。

解凍過程中有發(fā)生次生結(jié)冰，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷，以及細(xì)胞吸水對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生沖擊的風(fēng)險(xiǎn)。因此，選擇適宜的解凍方式對(duì)花粉超低溫保存后恢復(fù)活力十分重要。目前采用較多的解凍方式有自來水化凍、室溫解凍、水浴解凍。本試驗(yàn)設(shè)置40℃水浴化凍2 min、自來水化凍5 min和25℃室溫化凍30 min等3個(gè)處理，結(jié)果顯示40℃水浴化凍（2 min）效果最好，這與前人對(duì)百合[22]和山茶[5]的研究結(jié)果相一致。

大量研究結(jié)果顯示，花粉含水率是花粉超低溫保存成敗的關(guān)鍵。含水率會(huì)影響花粉預(yù)冷凍和解凍方式的選擇，當(dāng)含水率過高時(shí)，花粉更容易產(chǎn)生冰晶，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷;當(dāng)含水率過低時(shí)，花粉無法滿足其基本生理需求。本試驗(yàn)中花楸花粉含水率在4.84%時(shí)，花粉冷凍前的萌發(fā)率為零，這與花粉生理性缺水會(huì)影響其生理活性有關(guān)，但經(jīng)過超低溫保存后，其花粉萌發(fā)率顯著升高，這種現(xiàn)象在山茶某些品種中也有出現(xiàn)[4]，其原因目前尚不清楚?；ǚ酆蕿?.94%和12.63%（為初始含水率）時(shí)花粉超低溫保存前后，花粉萌發(fā)率均有所下降，這可能與花粉相對(duì)含水率較高產(chǎn)生冰晶有關(guān)。花粉超低溫保存后，含水率為7.72%的花粉萌發(fā)率最高，且冷凍前后的萌發(fā)率無顯著差異。因此，建議花楸花粉經(jīng)干燥5 h（含水率為7.72%）后進(jìn)行超低溫保存，但是在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到經(jīng)濟(jì)快捷的原則，也可不進(jìn)行干燥，對(duì)初始含水率的花楸花粉直接進(jìn)行超低溫保存。

本試驗(yàn)分別探究了花粉超低溫保存不同技術(shù)環(huán)節(jié)下的最佳處理，對(duì)于不同處理組合間綜合作用關(guān)系及完整的花楸花粉超低溫保存體系的建立還有待于進(jìn)一步探究。

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