蘆葦腐解土中酚酸類化感物質(zhì)的水分響應特性研究

孫盈　李萍萍　付為國

摘 要：蘆葦和虉草均具有較強的去污能力，常作為濕地植物配置于同一人工濕地進行污水處理。蘆葦作為一種強化感植物對虉草具有較強的化感作用，在自然濕地和人工濕地中均會出現(xiàn)蘆葦代替虉草的現(xiàn)象，且這一現(xiàn)象的發(fā)生與土壤含水量存在一定聯(lián)系，此外，蘆葦腐解土對虉草的化感抑制效應與腐解土中總酚酸的量密切相關。為了研究蘆葦腐解土中主要酚酸類物質(zhì)的水分響應特性，篩選出其中對水分響應較為明顯的酚酸物質(zhì)種類，該研究采用高效液相色譜法，通過蘆葦枯落物腐解土的制備，對不同水分環(huán)境下蘆葦腐解土中酚酸類物質(zhì)進行了分離和鑒定。結果表明：蘆葦腐解土中可分離出沒食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸和苯甲酸等8 種酚酸類物質(zhì)，其中香豆酸、苯甲酸和阿魏酸等3種酚酸類物質(zhì)含量較高。分離出的8種酚酸類物質(zhì)的含量與腐解土的相對含水量均呈顯著線性負相關關系，即隨著腐解土相對含水量的上升，酚酸類物質(zhì)的含量均呈現(xiàn)下降趨勢，且各種酚酸類物質(zhì)對水分的響應趨勢均可用線性方程較好地擬合。其中，香豆酸、沒食子酸和阿魏酸對蘆葦腐解土的水分響應最為明顯。因此，可將香豆酸、沒食子酸和阿魏酸作為主要調(diào)控目標，通過調(diào)控濕地土壤中水分含量，削弱蘆葦對虉草的化感抑制效應，從而維持人工濕地中虉草蘆葦群落的長期穩(wěn)定共存。

關鍵詞： 蘆葦， 酚酸， 腐解， 化感作用， 水分響應

中圖分類號：Q945.7

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）05-0661-07

Response characteristics of phenolic acids substances tosoil moisture in Phragmites australisdecomposing soil

SUN Yin1， LI Pingping2， FU Weiguo1，2*

（ 1. Agricultural Engineering Research Institute， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， Jiangsu， China; 2.CooperativeInnovation Center of Southern Modern Forestry， Nanjing Forestry University， Nanjing 212013， China ）

Abstract：Both Phragmites australisand Phalaris arundinaceahave strong detergency capabilities and are often deployed as wetland plants in the same constructed wetland for sewage treatment. As a kind of allelopathic plant， Phragmites australishas strong allelopathy effects on Phalaris arundinaceaand P. arundinacea would be instead of Phragmites australisin both natural wetland and constructed wetland. This phenomenon is related to the soil moisture content and the allelopathic inhibitory effect of P. australisdecomposing soil on Phalaris arundinacea is closely related to the amount of total phenolic acids in the decomposing soil. Therefore， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to separate and identify phenolic acids substances in Phragmites australisdecomposing soil under different moisture content conditions to select the types of phenolic acids that the most obvious responded to moisture in this paper. The competition balance between P. australisandPhalaris arundinaceacan be achieved through the regulation of wetland soil moisture， therefore， the long-term stable coexistence of the two species in the constructed wetland can be achieved. The results showed that eight kinds of phenolic acids were separated and identified， which were gallic acid， coumaric acid， vanillic acid， syringic acid， p-coumaric acid， ferulic acid， salicylic acid， and benzoic acid， respectively. The contents of three kinds of phenolic acids of coumaric acid， benzoic acid， and ferulic acid were higher among eight kinds of identified phenolic acids. There was a significant linear negative correlation between content of every identified phenolic acid and the relative moisture content of the Phragmites australisdecomposing soil. With the increase of relative moisture content of P. australisdecomposing soil， content of every identified phenolic acid showed a downward trend， and the response curve of content of every identified phenolic acid to the relative moisture content of P. australisdecomposing soil could be fitted well with a linear equation. Responses of coumarinic acid， gallic acid， and ferulic acid to soil moisture were the most obvious among eight kinds of identified phenolic acids. Therefore， coumanic acid， gallic acid， and ferulic acid can be used as the main regulatory targets， the allelopathic inhibitory effects of P. australison Phalaris arundinacea can be weakened by regulating the moisture content of wetland soil so as to maintain the stability of Phragmites australisandPhalaris arundinaceacommunity.

Key words： Phragmites australis， phenolic acids， decomposition， allelopathy， response to moisture

蘆葦（Phragmites australis）是一種多年生根莖類禾本科植物，無性繁殖能力強，天然種群多以根莖繁殖補充更新為主，常在棲息地形成單優(yōu)群落，廣泛分布于江、河、湖、海岸及淤灘等（莊瑤等，2010）。國內(nèi)外的相關研究證實蘆葦是一種強化感植物，對藻類如藍藻（Nakai et al.，2006）及一些高等植物甚至是一些入侵植物如互花米草（鄭琨等，2009）、一枝黃花（劉成等，2014）均具有較強的化感抑制作用（付為國等，2013）。

盡管蘆葦對虉草具有很強的化感抑制作用，但是在蘆葦-虉草自然濕地和人工濕地中，蘆葦種群代替虉草種群這一現(xiàn)象均隨著濕地基底淤積抬高而逐漸發(fā)生（Bezinová & Vymazal，2014; Fu et al.，2015），鑒于蘆葦是一種強化感植物以及化感作用具有強烈的“隨著土壤水分降低，化感抑制效應增加”水環(huán)境響應特性（王春晴等，2011），我們有理由推斷：蘆葦種群對虉草種群的逐步替代過程正是蘆葦對虉草化感抑制效應隨基底抬升土壤含水量降低而逐漸增強的過程。事實上化感物質(zhì)的釋放途徑包括雨霧淋溶、植物揮發(fā)、植株殘體降解和根系分泌等（林娟等，2007），但只有進入土壤中的根系分泌物和植株殘體化學物質(zhì)與土壤水分含量相關性較高。其中，尹淇淋（2015）曾研究了蘆葦根系分泌物對虉草的化感抑制效應及其水環(huán)境響應特性，并用高效液相色譜法（HPLC）鑒定和分離出根系及根際土壤中含有香豆酸、香草酸、沒食子酸、苯甲酸、丁香酸、阿魏酸和水楊酸等7種酚酸物質(zhì);日本學者Nakai et al.（2006）從蘆葦腐解液中分離出了香豆酸、阿魏酸、沒食子酸和香草酸等酚酸類化感物質(zhì)。關于化感物質(zhì)的另一主要來源的植物殘體和枯落物，有研究曾利用磷鉬酸-磷鎢酸鹽比色法測試和分析了蘆葦枯落腐解物中總酚酸的含量及其對虉草的化感抑制效應（付為國等，2015），但并未對枯落腐解物中所含的酚酸類物質(zhì)進一步鑒定、分離和測定，更未對其水分響應特性進行研究。因此，本研究將利用HPLC法，通過蘆葦枯落物腐解土的制備，對不同水分條件下蘆葦枯落物腐解土中各酚酸類物質(zhì)進行鑒定、分離和測定，將其中對水分響應較為明顯的酚酸類物質(zhì)作為主要調(diào)控目標，通過調(diào)控濕地土壤中水分含量，維持虉草蘆葦種群長期競爭共存，從而為虉草蘆葦人工濕地的群落穩(wěn)定管理提供理論支持和技術指導。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

長江下游鎮(zhèn)江濱江濕地（119°28′E，32°15′N）氣候屬暖溫帶向北亞熱帶過渡的季風帶氣候，受季風影響，四季分明，氣候溫暖濕潤，年平均氣溫為15.4 ℃，年降水量為1 074.0mm，年蒸發(fā)量為847～1 755.9mm。該濕地是由江水攜帶的泥沙長年淤積而成，水文狀況復雜，既有感潮河段的日變化，又有豐水期、平水期和枯水期的季節(jié)變化。濕地植物生長茂盛，植被發(fā)育于江灘裸地的原生演替，隨著濕地基底抬升，蘆葦群落逐漸替代虉草群落成為濕地的頂級群落。

1.2 材料與實驗設計

蘆葦枯落物收集和處理：2016年11月初，于鎮(zhèn)江濱江濕地收集枯死的蘆葦植株，曬干后粉碎成末。同期自濱江濕地光灘采取一定量新淤積的泥土，曬干、磨碎、去雜、過篩。然后將泥土和蘆葦粉末按3∶1的體積比混合均勻（比例參考濱江濕地土壤與蘆葦殘體單位面積比），再將等體積混合后的土樣置于12個塑料桶（規(guī)格：上徑24 cm、下徑26 cm、高22 cm）內(nèi)腐解。腐解期間設置4個水分處理：T1、T2、T3和T4（表1），每個處理3次重復，即每個塑料桶為1個處理的一次重復。腐解期間利用稱重法維持各處理的土壤含水量在設置的范圍內(nèi)。2017年11月1日，分別進行各處理腐解土中酚酸類物質(zhì)的分離、鑒定和測定，后取其均值分析。

1.3 蘆葦腐解土中酚酸類物質(zhì)的 HPLC 分析

1.3.1 儀器與試劑 Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀（四元泵，UV檢測器，Chromeleon 7色譜工作站，Thermo Fisher公司）;R-201旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHZ-D（III）（真空泵河南予華儀器有限公司）;KH-100超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司）;Neofugo 18R高速離心機（力康生物醫(yī)療科技）;CHA-S氣浴恒溫振蕩器（金壇榮華儀器制造有限公司）;BSA224S電子分析天平（萬分之一，德國Sartorius）。標準品沒食子酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸、香豆酸、丁香酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸、水楊酸、咖啡酸、芥子酸、綠原酸，購自上海晨易生物公司。

1.3.2 色譜條件 色譜柱為Thermo Accucore XL C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）;流動相A為甲醇色譜純;流動相B為1%乙酸水溶液;UV檢測波長為280 nm;柱溫為30 ℃;梯度洗脫條件：0～8 min，甲醇5%～40%;8～19 min，甲醇40%～35%;19～30 min，甲醇10 %;流速為1 mL·min-1。

1.3.3 標準溶液的配制 準確稱取上述10種酚酸標準品各10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解并定容，得1 mg·mL<SUP>-1</SUP>的10種酚酸溶液混合液，依次用50%甲醇水溶液稀釋2、10、50、100倍配制成系列標準樣品混合溶液。同時，準確稱取 10種酚酸標準品各1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解并定容，得1 mg·mL<SUP>-1</SUP>的單一種酚酸溶液，用于液相色譜單峰的鑒別與定性。

1.3.4 蘆葦腐解土樣品溶液的制備 取蘆葦腐解土10 g，置錐形瓶中，加入50%甲醇水溶液100 mL常溫下震蕩提取6 h后上離心機分離取上清液，再用旋轉蒸發(fā)儀（真空，30 ℃）濃縮成1 mL樣品溶液，過0.22 μm有機過濾膜。

1.4 統(tǒng)計分析

對蘆葦腐解土中酚酸物質(zhì)含量與土壤相對含水量的響應關系進行線性回歸分析。運用Excel 2007及SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 色譜分析條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇 對10種酚酸類物質(zhì)標準樣品進行最大吸收光譜掃描，掃描波長范圍為190～400 nm。分析不同酚酸類物質(zhì)的最大吸收光譜，10種酚酸類物質(zhì)在280 nm 左右均有較大吸收峰。因此，選取280 nm作為酚酸類物質(zhì)的定量檢測波長。

2.1.2流動相的選擇和優(yōu)化 由于酚酸類物質(zhì)中的酚羥基與羧基在水溶液中較易發(fā)生電離，使其水溶液極性有所增強，在固定相上會發(fā)生雙重保留，造成色譜峰拖尾嚴重，加入適量的酸性調(diào)節(jié)劑，可在一定程度上抑制多酚的電離，使極性減弱，增強其在固定相上的保留，使分離效果和峰形得到改善（劉江云等，2002）。本研究采用乙酸作為流動相的酸性調(diào)節(jié)劑，其濃度對酚酸類物質(zhì)的出峰時間和峰型均有一定影響。分別考察了0.5%～2% 不同濃度乙酸水溶液對10種酚酸類物質(zhì)的分離效果，最終選擇了1%乙酸水溶液。在采用等度流動相洗脫時，各峰的分離效果不夠理想，采用梯度洗脫后各峰分離較好，經(jīng)過多次梯度洗脫條件優(yōu)化篩選，最理想洗脫條件為0～8 min，甲醇5%～40%;8～19 min，甲醇40%～35%;19～30 min，甲醇10%;流速為1 mL·min-1。在此梯度條件下，10種酚酸類物質(zhì)均能得到較好的分離，色譜峰峰形良好、保留時間穩(wěn)定。

2.2 蘆葦腐解土中酚酸類物質(zhì)種類的鑒定

分別將適量的單一酚酸標準溶液加入混合酚酸標準品中進行分析，通過與未加入單一酚酸標準溶液的混合酚酸標準品色譜圖進行對比，將峰面積明顯增大的峰認定為該酚酸的色譜峰，以此方法逐一確認10種酚酸的相應位置和出峰時間。根據(jù)出峰時間將蘆葦腐解土樣品溶液色譜圖與混合標準品色譜圖進行對比，確定蘆葦腐解土樣品溶液中含有沒食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸和苯甲酸等8種酚酸類化合物。酚酸混合標準品色譜圖和蘆葦腐解土樣品溶液色譜圖見圖1。

2.3 蘆葦腐解土中酚酸類物質(zhì)水分響應關系

將已逐級稀釋配制的10種酚酸混合液分別進樣10 μL，以各種酚酸濃度x（μg·mL<SUP>-1</SUP>）為橫坐標，其峰面積值S（mAU）為縱坐標繪制標準曲線，計算得到10種酚酸物質(zhì)的線性回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍，以儀器信噪比（S/N≥3）確定 10 種酚酸物質(zhì)的最低檢出限（表2）。10種酚酸物質(zhì)的線性回歸方程的判定系數(shù)均在0.999以上，在P<0.01水平極顯著相關，因此適用于對蘆葦腐解土中酚酸類物質(zhì)的HPLC定量計算分析。

根據(jù)以上各標準曲線的線性回歸方程，計算出不同處理下蘆葦腐解土樣品溶液中各酚酸類物質(zhì)的含量。進而將各酚酸類物質(zhì)含量與其對應蘆葦腐解土的相對含水量進行線性回歸擬合，得出各擬合方程和擬合圖（圖2）。由判定系數(shù)可知，利用線性方程Y=ax+b擬合各酚酸類物質(zhì)對土壤水分的響應，擬合效果很好。顯著性分析顯示，被鑒定出的8種酚酸類物質(zhì)含量與其環(huán)境中腐解土相對含水量均呈極顯著的負相關關系（P<0.01）。由各酚酸類物質(zhì)對水分擬合方程的斜率判定，香豆酸對腐解土相對含水量的響應最為明顯，其次為沒食子酸和阿魏酸，然后依次是香草酸、對香豆酸、水楊酸和苯甲酸，而響應關系最弱的是丁香酸。

3 討論與結論

土壤中微生物可以利用酚酸作為碳源和能量，在限制性條件下酚酸可為固氮菌提供碳源是酚酸化感活性能否表現(xiàn)的決定因素，也就是說微生物既能降低也可以放大酚酸的毒性，而土壤水分是土壤中可溶性有機質(zhì)有效性和可移動性的主要控制因子（Casals et al.，2000）?？扇苄杂袡C質(zhì)是土壤微生物主要的呼吸底物和能量來源（陳全勝，2003）。因此，土壤水分狀況的變化會對土壤的微生物呼吸產(chǎn)生深刻影響，從而影響酚酸物質(zhì)的化感活性。與此同時，土壤水分增加使得土壤透氣性下降，O2含量減少，也在一定程度上影響土壤中的硝化作用與固氮作用，而土壤微生物的固氮作用在一定程度上決定酚酸物質(zhì)的轉化與化感活性（Kefeli et al.，2003）。因此，蘆葦腐解土中酚酸類化感物質(zhì)的水分響應可能是通過土壤透氣性、土壤中氮循環(huán)及微生物活動等多種因子綜合作用實現(xiàn)的。

植物枯落殘體可通過腐解向土壤中釋放對自身或其他植物具有明顯化感作用的酚酸類物質(zhì)。吳立潔（2014）從三七根際土壤中檢測到對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、苯甲酸6種酚酸類物質(zhì)，并證實酚酸在三七根際土壤中的含量已達到顯著抑制三七生長的含量;張金燕等（2017）的研究結果表明三七連作土壤中的大多數(shù)酚酸類化合物可能不是主要的化感物質(zhì)，其土壤提取液對部分作物種子的萌發(fā)表現(xiàn)出濃度依賴性;李坤等（2011）發(fā)現(xiàn)葡萄根系腐解物中的苯甲酸、苯丙酸和水楊酸對山河二號葡萄（Vitis amurensis × V. riparia）組培苗具有顯著的化感抑制作用。本研究以10種較為普遍的具有化感效應的酚酸類物質(zhì)為標樣，采用HPLC技術在蘆葦腐解土中鑒定出沒食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸和苯甲酸等8 種酚酸類物質(zhì)。檢出酚酸物質(zhì)種類與尹淇淋（2015）從蘆葦根系中分離的酚酸物質(zhì)相比多檢出對香豆酸，比Nakai et al.（2006）從蘆葦腐解液中分離的酚酸類物質(zhì)多檢出丁香酸、對香豆酸、水楊酸和苯甲酸，即蘆葦枯落殘體腐解土與蘆葦根系和蘆葦腐解液的酚酸物質(zhì)種類不盡相同，這可能是由于土壤微生物在一定程度上影響了酚酸物質(zhì)的化感活性。蘆葦腐解土中8種酚酸類物質(zhì)的含量與其土壤相對含水量均呈現(xiàn)顯著線性負相關關系，即隨著蘆葦腐解土相對含水量的上升，酚酸類物質(zhì)均呈現(xiàn)下降趨勢，且不同酚酸類物質(zhì)的含量與腐解土相對含水量的關系可用線性方程加以擬合。不同種類酚酸物質(zhì)對腐解土中的水分響應強度存在較大差異，其中，香豆酸的含量對腐解土中的水分響應最為明顯，其次為沒食子酸和阿魏酸。

通過研究蘆葦腐解土中酚酸類物質(zhì)的含量對水分響應關系，得出眾多的酚酸類物質(zhì)中香豆酸、沒食子酸和阿魏酸3種酚酸類物質(zhì)對土壤水分具有較強的響應特性，即隨著土壤含水量的上升，它們的含量降幅更加明顯。因此，在虉草-蘆葦人工濕地植物群落穩(wěn)定性維護過程中，可將香豆酸、沒食子酸和阿魏酸3種酚酸類物質(zhì)作為主要調(diào)控目標，通過調(diào)控濕地土壤中水分含量，削弱蘆葦對虉草的化感抑制效應，從而維持虉草-蘆葦群落的穩(wěn)定。事實上，這一結論是基于不同酚酸類物質(zhì)的含量對土壤水分響應所得到的。然而，在眾多的酚酸物質(zhì)中，或許存在某種物質(zhì)，盡管土壤水分的增加使其在含量上僅出現(xiàn)較小的降低，即其含量對水分響應較弱，但其化感抑制效應或許出現(xiàn)明顯的減弱，這一類化感物質(zhì)同樣可作為主要調(diào)控目標。因此，這就需要針對不同酚酸類物進行化感抑制的劑量效應研究，從而更為全面精確地篩選出合理的調(diào)控目標，通過濕地土壤水分調(diào)控，以達成虉草蘆葦間的競爭平衡，從而維持人工濕地中兩物種的長期穩(wěn)定共存。

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