GYY4137和雙膦酸鹽對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥治療效果的對比研究

戴楓 黃國鑫 徐忠世

摘要：目的 通過測量大鼠椎體及股骨骨密度、股骨生物應(yīng)力數(shù)據(jù)及顯微鏡下觀察股骨骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，對比研究分析外源性 H2S?供體 GYY4137 及雙膦酸鹽類代表藥物阿侖膦酸鈉對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療效果。方法 通過切除大鼠雙側(cè)卵巢建立經(jīng)典的骨質(zhì)疏松模型，模擬圍絕經(jīng)期婦女雌激素驟減、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂所致的骨質(zhì)疏松疾病過程，大鼠隨機分組通過腹腔注射 GYY4137 或阿侖膦酸鈉進行干預(yù)，使用改良亞甲藍法測定血漿硫化氫濃度，使用雙能 X 射線骨密度儀測量第

4、5?腰椎椎體及股骨骨密度;通過股骨三點彎曲實驗測量股骨骨折最大應(yīng)力值。所有數(shù)據(jù)由 SPSS?22.0?軟件處理分析。同時在顯微鏡下微觀定性對比觀察各組大鼠股骨 H&E ?染色切片骨小梁分布情況。結(jié)果 ?去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型下，腹腔注射

GYY4137 模擬內(nèi)源性 H2S 可提高了血漿 H2S 濃度，在顯微鏡下觀察到股骨骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的明顯改善，與阿侖膦酸鈉治療組無明顯差異，在各個時間段 GYY4137 和阿侖膦酸鈉干預(yù)組在第 4、5 腰椎骨密度及股骨最大應(yīng)力負(fù)荷測量數(shù)據(jù)上同正常對照組無統(tǒng)計學(xué)意義上的差別（p>0.05）。在第 12 周，大鼠第 4 腰椎骨密度和大鼠股骨骨密度在 GYY4137 干預(yù)組較 OVX 實驗對照組有增加（p<0.05）。結(jié)論 GYY4137 作為近年熱點研究的一種新型 H2S 緩釋供體，在實驗中和阿侖膦酸鈉的干預(yù)效果類同，對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療有效。

關(guān)鍵詞：雌激素;骨質(zhì)疏松;H2S;骨密度;最大應(yīng)力;去卵巢

【中圖分類號】R681 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）05-005-03

骨質(zhì)疏松伴隨骨量減少和骨脆性增加，極易造成骨折和傷殘等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量， 甚至縮短患者壽命 [1]。骨質(zhì)疏松最常發(fā)生于絕經(jīng)后婦女， 被稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 （PMOP） [2]，雌激素和多種內(nèi)源性激素在體內(nèi)調(diào)節(jié)影響著骨代謝，補充外源性激素進行替代治療是目前常用的治療手段之一，但同時增加了患者生殖系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險 [3]。在研究中，我們選取了去卵巢大鼠這一經(jīng)典實驗?zāi)Ｐ蛠砟M絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過程。證實了外源性腹腔注射 GYY4137 可以提高大鼠血漿的 H2S 濃度水平，提高了大鼠腰椎及股骨骨密度數(shù)據(jù)，抵消反轉(zhuǎn)了因雌激素缺乏所致對骨代謝的相關(guān)影響，微觀上股骨 HE 染色的鏡下觀察也佐證了干預(yù)治療效果，GYY4137 干預(yù)下

OVX?大鼠股骨骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)和正常對照組及阿侖膦酸鈉干預(yù)組相差無幾。

1.1?試劑和化學(xué)物質(zhì)

GYY4137 購買于 Santa Cruz Biotechnology （SC-224013）， 使用 0.9% 的生理鹽水稀釋。

阿倫瞵酸鈉（阿拉丁，A115345），同樣使用 0.9% 的生理鹽水稀釋。

水合氯醛（Sangon Biotech， Shanghai， China）

青霉素、戊巴比妥鈉、生理鹽水等均購于正規(guī)國內(nèi)生產(chǎn)廠商。

1.2?動物實驗材料和方法

80?只 6?月齡 SPF?級雌性 SD?大鼠，體重 265±15g，購于廣東省實驗動物中心。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1?周后進行分組和骨質(zhì)疏松造模，隨機分為正常對照組（sham-GYY）、實驗對照組 （OVX-vehicle）、GYY4137（GYY）干預(yù)組 （OVX-

GYY）?和阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）。每組 20?只;其中實驗對照組、GYY4137（GYY）干預(yù)組和阿倫瞵酸鈉干預(yù)組進行骨質(zhì)疏松造模，大鼠使用 320mg/kg?劑量水合氯醛麻醉后，腹部開口，完整摘除雙側(cè)卵巢（ovariectomy，

OVX），關(guān)腹。正常對照組大鼠進行假手術(shù)處理：大鼠開腹后分離卵巢組織，關(guān)腹，不做卵巢切除術(shù) ， 手術(shù)過程中動物無大出血。術(shù)后待大鼠自然清醒，青霉素（4?萬U/?只） 治療 3 天避免感染。術(shù)后，正常對照組大鼠腹腔注 100μg/ kg?GYY4137（santa?cruz，sc-224013），實驗對照組大鼠腹

腔注射 1mg/kg?生理鹽水，阿倫瞵酸鈉干預(yù)組大鼠皮下注射 1mg/kg?阿侖膦酸鈉（?阿拉丁，A115345），GYY4137 干預(yù)組大鼠腹腔注射 100μg/kg?GYY4137（santa?cruz，sc-

224013），用藥次數(shù)均為 2?天 /?次。于給藥 2、4、8、12?周后每組各 5?只大鼠使用戊巴比妥鈉注射麻醉，腹主動脈采血，分離血漿。于給藥 2、4、8、12?周后每組各處死 5?只大鼠，完整取出雙側(cè)股骨，剔除軟組織和附件。于給藥 8、

12?周后完整取出各組大鼠腰椎體，同樣剔除軟組織和附件， 僅僅保留椎體。股骨和腰椎椎體用浸透生理鹽水的紗布包裹后，分組標(biāo)記保存于-80℃冰箱中。大鼠由專人飼養(yǎng)，在溫度 23±2℃，相對濕度 55±10%?以及晝夜交替各 12?小時

的受控條件下，自由進食和飲水。實驗期為 12 周，實驗過程中沒有大鼠意外死亡。以上所有的實驗步驟均嚴(yán)格按照中國科技部的《實驗動物的管理和使用指南》進行。

1.3?血漿 H2S 濃度檢測

改良亞甲基藍法測定血漿硫化氫，先加過量醋酸鋅溶液使血漿中游離 H2S、HS-、S2-?形成 ZnS?沉淀; 再加入5mol/L NaOH?強堿溶解變性的蛋白;離心去除大量蛋白質(zhì); 再加入 0.2% N，N-?二甲基對苯二胺鹽酸鹽溶液使 ZnS?完全溶解，用三氯乙酸沉淀剩余蛋白質(zhì)，最后用分光光度計法測定 H2S?濃度。

1.4?H&E 染 色 （Hematoxylin-eosin?staining）

在 4% 濃度的多聚甲醛固定后，股骨樣品脫鈣，然后再遞增濃度的乙醇中脫水，再二甲苯中清洗并植入組織學(xué)石蠟中，使用厚度為 5μm 切片進行 H&E 染色。

1.5?骨密度檢測

骨密度檢測使用美國產(chǎn) Hologic 雙能 X 射線 4500W 骨密度儀（DEXA）分次測定第 4、第 5 腰椎椎體和雙側(cè)股骨骨密度（BMD）。

1.6?生物力學(xué)檢測

取股骨樣本進行生物力學(xué)檢測，方法為三點彎曲實驗， 測量股骨骨折時所承受的最大應(yīng)力。儀器為 ElectroForce 3200 Series II Test Instrument，BOSE。

1.7?統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用 SPSS 22.0 軟件進行處理，根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果，兩組間比較采用兩樣本 t 檢驗。P ﹤ 0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 ， P ﹤ 0.01 認(rèn)為差異具有顯著性。

2.1?各組血漿 H2S 濃度的變化

和 Sham-GYY?組比較，OVX-vehicle?和 OVX-ALEN?血漿中硫化氫（H2S）含量均有下降或顯著降低，而 OVX-

GYY?組血漿中硫化氫含量變化不明顯。如圖 1。通過腹腔注射 GYY?在第 2?周和第 4?周顯著提高了的 OVX?大鼠血漿 ?H2S ??濃 ?度 ，（13.47±3.64 vs. 5.00±1.33;11.28±1.95?vs.

5.08±2.36;所有 p<0.01，如圖 1），隨著時間推移，在第

8?周和第 12?周外源性 GYY?對大鼠血漿 H2S?濃度的提升影響仍顯示有效（11.20±3.53?vs.?5.63±2.32;13.08±2.99?vs.

5.98±2.06;所以 p<0.05，如圖 1）。

組 sham-GYY?比較; # 表示 p<0.05，?與實驗對照組 OVX-

vehicle 比較;## 表示 p<0.01， 與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

2.2?股骨組織的切片 H&E 在顯微鏡下觀察

實驗對照組在顯微鏡下可以觀察到骨小梁結(jié)構(gòu)的明顯崩塌減少稀疏，這確認(rèn) OVX 骨質(zhì)疏松造模的成功，而OVX-ALEN 和 OVX-GYY 組可以觀察到大鼠股骨骨小梁的恢復(fù)，這個結(jié)果定性顯示了補充外源性 H2S 和阿倫瞵酸鈉均對骨質(zhì)疏松病情的恢復(fù)和改善有治療效果（如圖 2）。

2.3?GYY4137?減緩去卵巢疏松和腰椎股骨骨密度減低于正常對照組比較，大鼠第 4、5?腰椎于去卵巢后

（OVX-vehicle）第 8 周及之后第 12 周均顯示骨質(zhì)密度減低

（0.195±0.007 vs. 0.244±0.023;0.193±0.017 vs.?0.239±0.013; 0.182±0.022 vs. 0.223±0.016;0.180±0.023 vs.?0.232±0.026;

所有 p<0.05;如圖 3）;差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。同時在第

12?周大鼠第 4?椎體樣本結(jié)果顯示 GYY4137?干預(yù)組 （OVX-

GYY）?反轉(zhuǎn)了去卵巢導(dǎo)致的腰椎骨密度降低（0.190±0.040 vs.?0.182±0.022;p<0.05;?如圖 3c）;?對骨質(zhì)疏松的治療效果甚至優(yōu)于同組阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）。在大鼠雙側(cè)股骨骨密度測量實驗中顯示，第 12?周實驗對照組 （OVX-vehicle）?相比正常對照組（sham-GYY）股骨密度降低（0.260±0.030?vs.?0.332±0.035;p<0.05;?如圖 4b）， 通過阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）?和 GYY4137?干預(yù)組（OVX-GYY）?反轉(zhuǎn)了實驗對照組 （OVX-vehicle）?去卵巢導(dǎo)致的股骨密度減低（0.310±0.023?0.314±0.046?vs.?0.260±0.030;

p<0.05;如圖 4b），數(shù)據(jù)結(jié)果顯示阿倫瞵酸鈉和 GYY4137 對骨質(zhì)疏松治療效果基本相同。

周測量圖示。（*?表示 p<0.05，?與正常對照組 sham-GYY 比較;**?表示 p<0.01，?與正常對照組 sham-GYY?比較;

# 表示 p<0.05，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較;## 表示p<0.01，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

（*?表示 p<0.05，與正常對照組 sham-GYY?比較;**?表示

p<0.01，與正常對照組sham-GYY 比較; # 表示p<0.05，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較;## 表示 p<0.01，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

2.4?股骨骨折最大應(yīng)力測試

股骨骨折最大應(yīng)力測試，通過格拉布斯準(zhǔn)則法（Grubbs） 剔除相關(guān)異常值，結(jié)果分析表明：在 12?周時實驗對照組（OVX-vehicle）?大鼠股骨三點彎曲實驗所承受的最大骨折應(yīng)力數(shù)值有下降（121.59±26.56?vs.?157.79±14.83;p<0.05;如圖 5b），OVX 骨質(zhì)疏松模型改變了大鼠股骨的最大生物力學(xué)載荷，符合骨質(zhì)疏松的發(fā)生。而通過阿拉丁和 GYY4137 干預(yù)的大鼠，最大負(fù)荷應(yīng)力與正常對照組無明確統(tǒng)計學(xué)差別（p>0.05）; 而阿拉丁和GYY4137 干預(yù)組之間進行對比， 也無明顯統(tǒng)計學(xué)差別（p>0.05;圖 5ab）。

圖 5 大鼠雙側(cè)股骨骨折最大應(yīng)力數(shù)值：a 第八周大鼠雙側(cè)股骨樣本骨折最大應(yīng)力圖示;b 第 12 周大鼠雙側(cè)股骨樣本骨折最大應(yīng)力圖示。（* 表示 p<0.05，與正常對照組sham-GYY 比較;** 表示 p<0.01，與正常對照組 sham-GYY 比較; # 表示p<0.05，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較;## 表示 p<0.01，與實驗對照組 OVX-vehicle 比較）

在我們的研究中，通過實驗大鼠去卵巢來重現(xiàn)模擬了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過程，股骨 HE?染色的鏡下微觀骨小梁觀察、大鼠腰椎及股骨骨密度、大鼠股骨最大骨折應(yīng)

力數(shù)據(jù)均確切表明去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松這一經(jīng)典實驗?zāi)Ｐ偷某闪?。通過腹腔注射外源性 H2S?供體 GYY?可以有效提高大鼠血漿的 H2S?濃度水平，改善反轉(zhuǎn)了因雌激素缺乏導(dǎo)致的大鼠腰椎骨密度和股骨最大應(yīng)力降低，多組實驗數(shù)據(jù)顯示阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）?和 GYY4137?干預(yù)組（OVX-GYY）?對比正常對照組大鼠無統(tǒng)計學(xué)意義上的差別， 在第 12?周大鼠第 4?腰椎骨密度數(shù)據(jù)顯示 GYY?甚至優(yōu)于阿倫瞵酸鈉的干預(yù)治療效果，大鼠股骨的鏡下對比觀察也證實了這一點，GYY?的干預(yù)下 OVX?大鼠股骨骨小梁的結(jié)構(gòu)和數(shù)目和正常對照組及阿侖膦酸鈉干預(yù)組無顯著性差別。

骨代謝在分子層面的調(diào)節(jié)同時存在多種信號通路相互影響，其對骨形成和骨吸收起著重要的作用 [4]。其中骨形成發(fā)生蛋白（BMP）/Smads?通路及 Wnt/β-?連環(huán)蛋白

（catenin）通路主要影響骨形成，而骨保護素（OPG）/?核因子 κ?B受體活化因子配體（RANKL）/?核因子 κ?B受體活化因子（RANK）通路則主要影響骨吸收。有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生的H2S 可以調(diào)節(jié)成骨分化，H2S 減少缺乏可使鈣離子通道的巰基化減少，影響細胞壁 Ca2

+ 通道的內(nèi)流，進而下調(diào) PKC/ERK?介導(dǎo)的 Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控的間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。H2S?還可通過影響 BMP/Smads?通路的重要轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合蛋白（Cbfα1/?Runx2）?和 Osterix?相互作用， 促進骨細胞的增值和分化，以及進一步啟動成骨細胞特異性因子（如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白）的表達，從而促進骨的形成

[6]。BMP/Smads?和 Wnt/β-catenin?信號通路存在相互調(diào)節(jié)作用 [7]，H2S?同樣也在實驗中觀察到通過 MAPKs?途徑中的

EPK1/2 和 p38 依賴的機制對抗氧化應(yīng)激損傷，促進成骨細胞的分化和增殖，減輕炎癥反應(yīng) [8]。這些報道和本實驗的結(jié)果一致并相互驗證，說明了 H2S 對骨代謝的有益作用， 具有潛在改善骨質(zhì)結(jié)果的效果。

傳統(tǒng)上硫化氫被認(rèn)為是一種劇毒臭雞蛋氣味的有害物質(zhì)，高濃度下的毒性作用主要由于其抑制線粒體中的細胞色素 C 氧化酶，對線粒體的抑制作用甚至強于氰化物，有報道 H2S 在人體中毒時血液硫離子濃度為 3-995μM[9]。生理濃度和最低中毒濃度較為接近，高劑量的 H2S 甚至可誘

導(dǎo)實驗鼠脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及感染性休克患者血漿H2S 濃度同步增高 [10]。本動物實驗以大鼠為研究對象，而實際上外源性 H2S 對人體的實驗數(shù)據(jù)結(jié)果可能存在差異， 不同濃度的硫化氫、不同的給藥方式、給藥速度對骨質(zhì)疏松的影響及其長期使用對心肝腎等重要臟器功能的影響有待進一步實驗觀察確認(rèn)，總之，本研究創(chuàng)新性地對比觀察了 GYY4137 和雙膦酸鹽類藥物阿侖膦酸鈉對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的實際治療效果。結(jié)論表明外源性給予 GYY4137 來提高血漿 H2S 濃度有益大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療，這或許是另一個人類骨質(zhì)疏松癥的治療的潛在靶點，對今后骨質(zhì)疏松癥的新藥開發(fā)研究具有有益的提示作用。

639-650.

oxidative stress and its acceleration by loss of sex steroids. J Biol Chem. 2007;282（37）：27285–97