一株反硝化細(xì)菌在尾水中的脫氮性能研究

趙志瑞　蕭未　劉碩　張佳瑤

摘 要：為了提高城市尾水中氮的去除率，優(yōu)化篩選出一株好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌，通過調(diào)整尾水的氨氮濃度，研究其在不同氨氮濃度的尾水中的反硝化能力。結(jié)果表明：好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h的硝化和反硝化能力較強，在24，48 h硝態(tài)氮降解率分別達到83.1%和91.1%;在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L的城市尾水中，總氮、氨氮、硝態(tài)氮去除效果最明顯，去除率分別為56.9%，70.2%，91.1%;亞硝態(tài)氮出現(xiàn)累積，累積率為20%;氨氮質(zhì)量濃度為15，25 mg/L條件下，總氮與氨氮去除效果明顯降低;在25 mg/L條件下，亞硝態(tài)去除率增加，硝態(tài)氮去除率不明顯。因此，好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L的城市尾水中進行異養(yǎng)硝化和好氧反硝化作用的效果最好，其在實驗過程中以去除氨態(tài)氮為主。所采用的細(xì)菌脫氮方法與傳統(tǒng)的生物脫氮相比具有節(jié)約運行成本、耐氧性好、平衡p值等優(yōu)勢，有著廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：水污染防治工程;同步硝化;好氧反硝化;城市尾水;氨氮濃度

中圖分類號：X523?? 文獻標(biāo)志碼：A

Abstract：In order to remove nitrogen from urban tail water， a aerobic simultaneous nitrification-denitrification denitrifying bacteria is optimized and the denitrification ability of the bacteria in tail water with different ammonia nitrogen concentration is studied through adjusting the concentration of ammonia nitrogen in tail water， The results show that the simultaneous Nitrification-aerobic denitrification bacteria FX7h has strong nitrification and denitrification ability， and the degradation rate of nitrate nitrogen reaches 83% and 91% at 24 h and 48 h; the removal efficiency of total nitrogen， ammonia nitrogen and nitrate nitrogen is most obvious in 10 mg/L urban tail water， and the removal rates are 56.9%， 70.2%， and 91.1%， respectively; The nitrite nitrogen has a cumulative rate of 20%; under the mass conditions of 15 mg/L and 25 mg/L of ammonia nitrogen concentration， the removal efficiency of total nitrogen and ammonia nitrogen decreases significantly; under the condition of 25 mg/L， the removal rate of nitrous acid increases and the removal rate of nitrate nitrogen is not obvious. So the aerobic simultaneous nitrification denitrification bacteria FX7h has the best effect on heterotrophic nitrification and aerobic denitrification in urban tailwater with a concentration of 10 mg/L， and the ammoniacal nitrogen is mainly removed during the experiment. Compared with traditional biological nitrogen removal， the bacteria denitrification has the advantages of saving operating cost， oxygen resistance， balanced p value， etc.， and has broad application prospects.

Keywords：water pollution prevention project; simultaneous nitrification; aerobic denitrification; urban tailwater; ammonia nitrogen concentration

傳統(tǒng)的生物脫氮過程分為硝化（N+4→NO-2→NO-3）和厭氧反硝化（NO-3→NO-2→NO→N2O→N2）兩個過程，需要分別在好氧和厭氧條件下完成[1-2]。20世紀(jì)80年代，ROBERTSON等[3]報道了好氧反硝化細(xì)菌和好氧反硝化酶系的存在，為生物脫氮技術(shù)提供了一種嶄新的思路。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌約50多個屬，130多個種，包括了無色桿菌屬（Achrombacter）、短桿菌屬（Brevibacterium）、蒼白桿菌屬（Ochrobacturum）等[4]。其中環(huán)境中最普遍存在的好氧反硝化細(xì)菌為假單胞菌屬（Pseudomonaceae）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、副球菌屬（Paracoccus）等[5]。與厭氧反硝化細(xì)菌的反硝化相比，好氧反硝化細(xì)菌（多為異養(yǎng)硝化菌）的硝化過程和反硝化過程可同時進行，硝化的產(chǎn)物可直接作為反硝化的底物，除去了NO-3和NO-2的積累對反硝化的抑制作用，提高了生物脫氮的速度，且這個過程酸堿相對平衡，能使p值保持在一定范圍之內(nèi)[6-7]。

中國北方區(qū)域降雨量較小，地表水體的生態(tài)基流匱乏[8-9]，除了短暫的雨季，水源大部分是來自污水處理廠的尾水。污水處理廠排放的尾水或再生水的水量比較穩(wěn)定，已逐步成為中國北方區(qū)域河流的主要水源之一，但污水處理廠的尾水氨氮濃度限值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地表水V類標(biāo)準(zhǔn)，排入地表水體容易引起水體富營養(yǎng)化[10-11]，甚至導(dǎo)致水體黑臭，許多城市內(nèi)河出現(xiàn)了常年性或季節(jié)性的黑臭現(xiàn)象[12-13]。因此，進行尾水的深度凈化及河道的生態(tài)修復(fù)，增加地表水體的自凈能力具有重要的社會效益和環(huán)境效益[14-15]。本研究采用篩選的高效好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌進行尾水脫氮研究，分析了該菌的反硝化與氮代謝特性，以提高脫氮效率，強化尾水的深度凈化，緩解地表水質(zhì)惡化。

1 材料和方法

1.1 實驗設(shè)備

超凈工作臺（蘇凈集團·蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、水浴恒溫振蕩器TZ-82（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）、電熱鼓風(fēng)干燥箱101型（北京科偉永興儀器有限公司）、人工氣候箱LR-250-GS（廣東省醫(yī)療器械廠）、可見分光光度計22PC06119（上海棱光技術(shù)有限公司）、手提式壓力蒸汽滅菌器DSX-280B（上海申安醫(yī)療器械廠）、紫外可見分光光度計WFZ UV-2802（上海龍尼柯儀器有限公司）。

1.2 實驗菌株

菌株分離水樣采自石家莊市橋東污水處理廠A/O工藝的好氧池。

1.3 培養(yǎng)基

好氧同步硝化-反硝化菌富集培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度g/L）：檸檬酸鈉 3.7，（N4）2SO4 2.0，CaCO3 5.0，K2PO4 1.0，F(xiàn)eSO4·72O 0.4，MgSO4·72O 0.5，NaCl 2.0;在富集培養(yǎng)基中再加入2.5%瓊脂作為固體分離培養(yǎng)基[16]。鑒別培養(yǎng)基：在上述固體分離培養(yǎng)基中加入1 mL的1%（溶于酒精）溴甲基酚藍。

1.4 分析方法

氨氮的測定均采用納氏試劑分光光度法，亞硝酸鹽的測定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法，硝態(tài)氮采用紫外分光光度法，總氮的測定采用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法[17]。

1.5 菌株分離與純化

量取10 mL水樣，放入盛有100 mL滅菌的好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌富集液體搖瓶中，在30 ℃，150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h，取50 mL上清液轉(zhuǎn)接到100 mL新配制的反硝化細(xì)菌富集液體搖瓶中，重復(fù)上述實驗3次，得到反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)液。將得到的富集培養(yǎng)液在鑒別分離培養(yǎng)基上分線，30 ℃培養(yǎng)72 h。在鑒別培養(yǎng)基上選取藍色單菌落，在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)4次，挑取單菌落測定其反硝化能力，選取反硝化效果較好菌株進一步研究。

1.6 細(xì)菌鑒定

細(xì)菌16S rDNA通用引物進行鑒定，上游引物27f，下游引物1492r進行PCR擴增，PCR擴增總體系為50 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃—5 min，94 ℃—1 min，55 ℃—1 min，72 ℃—1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存[18]。

PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司（以下簡稱美吉生物）進行測序，測序結(jié)果通過Clustalx2.0比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化使用軟件MEGA 5.05。

1.7 實驗用水

實驗用水取自石家莊市橋東污水處理廠尾水排放河道洨河三環(huán)橋下，水質(zhì)狀況見表1。為了研究同步硝化-好氧反硝化菌在不同濃度下的脫氮性能，在城市尾水中加入氯化銨調(diào)整其氨氮濃度，濃度梯度為10，15，25 mg/L，通過添加葡萄糖控制C/N值為6，溫度控制為30 ℃，檢測好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌在氨氮濃度不同的條件下的脫氮性能。

2 結(jié)果和討論

2.1 菌株同源性分析

通過實驗反復(fù)篩選獲得4株好氧同步硝化-反硝化菌株，對所篩選菌株進行測序，Genebank比對，得到系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。

對圖1分析可知，其中FX1d與FX7h同源性較近，相似度達到99.6%。FX1d屬于Proteobacteria，Alphaproteobacteria，Rhizobiale，Rhizobiaceae，Sinorhizobium/Ensifer group;FX7h與Proteobacteria，Alphaproteobacteria，Rhodobacterales， Rhodobacteraceae，Paracoccus，相似度達到99%。ROBERTSON等對異養(yǎng)-好氧反硝化菌研究發(fā)現(xiàn)，該類菌的硝酸鹽還原酶不需要誘導(dǎo)，其反硝化途徑是組成型的，而且證實了無論培養(yǎng)基中有無硝酸鹽，都不會影響其硝酸鹽還原酶的活性[19]。FX2h與Alphaproteobacteria，Rhodobacterales，Rhodobacteraceae 相似度較高，為99%，表明該菌屬于α-變形菌門、紅球菌綱、紅球菌科，F(xiàn)X0h屬于球菌目的節(jié)桿菌科。

2.2 菌株對硝態(tài)氮的代謝能力

為了達到更好的反硝化效果，對4株好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌的氮代謝特征進行研究，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，培養(yǎng)基中，菌株FX7h與FX2h對硝態(tài)氮的降解率相對較高，2株菌都屬于紅球菌科，F(xiàn)X7h白色細(xì)菌在24，48 h硝態(tài)氮降解率達到83.1%和91.1%。FX2h淡紅色細(xì)菌的硝態(tài)氮降解率在24，48 h達到81.4%和88.5%。其余2株菌FX0h與FX1d降解硝態(tài)氮的效率較低，因此菌株FX7h為最佳脫氮菌株。本研究選取脫氮效果最好的好氧同步硝化-反硝化菌株FX7h作為研究對象。其形態(tài)與革蘭氏染色為陽性，菌株呈淡紅色、邊緣整齊，菌落為圓形，表面光滑，不透明。

2.3 在不同氨氮濃度的城市尾水中的脫氮效果

研究FX7h在不同氨氮濃度條件下的氮代謝特征，結(jié)果如圖3—圖5所示。

如圖3所示，總氮濃度逐漸降低，在開始時質(zhì)量濃度為18 mg/L，60 h后減少為7.8 mg/L，總氮的去除率達到56.9%。氨氮質(zhì)量濃度也由原來的10.6 mg/L降為4.04 mg/L，氨氮去除率達到70.2%。硝態(tài)氮去除效果最為明顯，去除率高達91.1%。由圖3可以看出，亞硝態(tài)氮逐漸升高，質(zhì)量濃度由開始時的0.14 mg/L積累到0.43 mg/L，亞硝態(tài)氮的累積率達到20%。這表明好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時，對總氮、氨氮的去除效果明顯，對硝態(tài)氮有較好的去除效果，同步硝化效果明顯，氨氮去除過程中，部分氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，由于對亞硝態(tài)氮的反硝化速率小于亞硝化速率，亞硝態(tài)氮出現(xiàn)積累，但對硝態(tài)氮的反硝化速率大于硝態(tài)氮的合成速率，表明該菌在該濃度下有較好的反硝化效果。

由圖4 可以看出，同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h對總氮和氨氮均有去除效果，60 h后總氮的質(zhì)量濃度從開始的18.2 mg/L降至10.7 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度由原來的15.9 mg/L降至7.8 mg/L，該菌對總氮和氨氮的去除率分別為40.9%和50.7%，比在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L的條件下總氮和氨氮的去除率明顯下降，表明氨氮濃度的增減抑制了好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h的活性，降低了該菌對總氮和氨氮的去除效率。硝態(tài)氮的質(zhì)量濃度由開始時的0.81 mg/L降至0.31 mg/L;開始時，在12 h時硝態(tài)氮濃度增加，主要由于氨氮濃度的增加，好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h 開始時溶解氧濃度較高，氨氮濃度較高，硝化效果較好，硝化速率大于反硝化速率，隨著反應(yīng)的進行，溶解氧大量被消耗，濃度降低，硝化速率逐漸降低，反硝化速率大于硝化速率，硝態(tài)氮濃度降低，IN等[20]的研究也出現(xiàn)了這樣的結(jié)果。亞硝態(tài)氮在氨氮質(zhì)量濃度為15 mg/L的條件下，濃度逐漸增加，從開始時的014 mg/L，60 h后升至0.44 mg/L，累積率達到207%，比氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L條件下的累積率變化更為不明顯，表明氨氮濃度的增加，對好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h的影響不明顯。

由圖5 可以看出，總氮和氨氮的濃度明顯降低，總氮質(zhì)量濃度從開始時的38.2 mg/L，60 h后降低為26.2 mg/L，降解率為31.5%;氨氮質(zhì)量濃度由原來的25.4 mg/L降低為13.4 mg/L，降解率為47%，表明好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時，對總氮和氨氮去除均有效果，相比于低濃度氨氮條件下，總氮與氨氮的降解率明顯下降，表明氨氮濃度的增加使好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h對總氮和氨氮的去除率降低。圖5顯示在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時，硝態(tài)氮的去除效果不明顯，表明好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在該條件下反硝化效率較低。亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度降低，從開始時的0.75 mg/L，60 h后降低為0.42 mg/L，亞硝態(tài)氮的去除效率為44%，表明在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時，由于氨氮濃度增加，促進了亞硝態(tài)氮的去除，表明該菌代謝亞硝態(tài)氮的能力更強。

以上對細(xì)菌FX7h代謝特征的分析表明，在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時，總氮、氨氮質(zhì)量濃度明顯降低，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度也出現(xiàn)降低，硝態(tài)氮去除效果變化不明顯，各形態(tài)氮沒有出現(xiàn)積累，這與SUN等[21]報道的好氧反硝化菌株T13脫氨態(tài)氮的結(jié)果一致。氨氮質(zhì)量濃度分別為10 mg/L和15 mg/L時，亞硝態(tài)氮有明顯的積累，氨氮、硝態(tài)氮質(zhì)量濃度減小，該結(jié)果與CEN等[22]研究的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株CPZ24相似，與LIANG等[23]報道的好氧反硝化細(xì)菌Paracoccus denitrificans DL-23脫氮特征一致。以上研究表明，具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的不同菌株脫氨態(tài)氮的方式具有不同特征。

3 結(jié) 語

1）確定了從城市污水中優(yōu)選的1株好氧同步硝化-反硝化菌株FX7h，該菌為紅球菌屬（Rhodococcus sp.）;

2）好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時，對總氮、氨氮的去除效果明顯，對硝態(tài)氮有較好的去除效果，同步硝化效果明顯，隨著氨氮濃度的升高，總氮、氨氮、硝態(tài)氮的去除率逐漸降低;

3）細(xì)菌FX7h對總氮和氨氮有較好的去除效果，在不同濃度氨氮條件下，該菌以去除氨氮為主。

4）好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，為生物脫氮提供了一種嶄新的思路，具有重要的應(yīng)用前景。該細(xì)菌能夠在有氧條件下去除受污染水體中的氮素，具有同步硝化-反硝化的能力。在污水處理中，有氧條件下，硝化和反硝化反應(yīng)可以在一個工段中同時進行，這將大幅度減少土地和資金的需求及管理難度。因此，進一步對好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌在高鹽分、低溫等極端環(huán)境下的氮素去除進行研究是下一步的研究方向。

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