RIPK3抑制對(duì)錳致大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及多巴胺能神經(jīng)元障礙的影響

何蓮瑜 劉丹丹 郭忠信 劉勝生 莫偉堅(jiān) 鄧祥發(fā)

摘要：目的：研究RIPK3抑制劑GSK’872對(duì)錳致大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及多巴胺能神經(jīng)元障礙的影響方法：將32只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、GSK’872對(duì)照組、錳中毒組、GSK'872干預(yù)組，每組8只。采用腹腔注射法對(duì)錳中毒組及GSK'872干預(yù)組的動(dòng)物染錳，建立亞急性錳中毒模型，同時(shí)干預(yù)組給予小腦延髓池注射GSK’872。動(dòng)物取材時(shí)取海馬及黑質(zhì)組織，采用Western blot和RT-qPCR法檢測(cè)GFAP及TH蛋白表達(dá)及RIP3基因表達(dá)的變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，GFAP的蛋白表達(dá)量明顯升高;黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)量降低; RIP3基因的表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與錳中毒組比較，GSK’872干預(yù)組GFAP蛋白表達(dá)量明顯下降，黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)升高;RIP3基因的表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：GSK’872干預(yù)可降低染錳大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞早期激活以及改善黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙，其機(jī)制可能與GSK’872能抑制神經(jīng)組織細(xì)胞壞死樣凋亡的發(fā)生有關(guān)。

前言

錳（Mn）是維持生理過(guò)程所必需的微量元素之一，但中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中錳的過(guò)度沉積可導(dǎo)致神經(jīng)異常，產(chǎn)生多種類似于帕金森?。≒D）的精神、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙的中毒癥狀[1]。己知錳中毒時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)反應(yīng)性增生和神經(jīng)炎癥促進(jìn)周圍組織的血運(yùn)重建，對(duì)CNS的變化具有適應(yīng)性保護(hù)作用，但過(guò)度的活化可引發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)的興奮性毒性、增強(qiáng)組織的氧化應(yīng)激及過(guò)度的炎癥反應(yīng)等損害作用[2]。當(dāng)過(guò)量的錳通過(guò)血腦屏障進(jìn)入CNS時(shí)，腦內(nèi)的錳優(yōu)先沉積在星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte，AS）中，尤其在細(xì)胞的線粒體內(nèi)，胞液中錳的整體濃度比神經(jīng)元高出50-60倍[3]，因此AS是錳神經(jīng)毒性的初始靶細(xì)胞[3]。已知錳中毒可同時(shí)誘發(fā)神經(jīng)組織細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死 [4]。近二十年研究不斷證實(shí)細(xì)胞壞死的發(fā)生在許多條件下也存在著程序性調(diào)控的機(jī)制，包括Necroptosis（壞死性凋亡），pyroptosis（細(xì)胞焦亡）、ferroptosis、Netosis（細(xì)胞鐵壞死）等調(diào)節(jié)性壞死的亞類相繼被發(fā)現(xiàn)和論證[5]。RIP3已然被確認(rèn)為調(diào)節(jié)依賴于RIP1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡在凋亡與壞死間發(fā)生轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子[6]。相繼發(fā)現(xiàn)的RIP1和RIP3的特異性抑制劑、包括Necrostatin-1、GSK'843和GSK'872[7]等為研究Necroptosis的相關(guān)機(jī)制提供了有效而關(guān)鍵的分子工具。

在早前的實(shí)驗(yàn)中我們觀察到：錳暴露可誘導(dǎo)大鼠海馬、黑質(zhì)等腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化[8]。RIP1特異性抑制劑Necrostatin-1可以降低體外培養(yǎng)染錳多巴胺能SK-N-SH細(xì)胞的壞死率、提高其存活度[9]，提示Necroptosis的調(diào)節(jié)機(jī)制可能參與了錳的神經(jīng)毒性。本研究擬通過(guò)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用RIP3的特異性抑制劑GSK'872干預(yù)錳致大鼠腦早期星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及多巴胺能神經(jīng)元障礙的影響，進(jìn)一步闡述錳誘導(dǎo)神經(jīng)組織細(xì)胞發(fā)生壞死的分子機(jī)制，并探討通過(guò)抑制細(xì)胞壞死發(fā)生來(lái)拮抗錳暴露對(duì)CNS的損傷作用的可行性。

1、材料與方法

1.1主要試劑與儀器MnCl2·4H2O（天津市博迪化工有限公司）;GSK'872（TargetMol，美國(guó)）;兔抗大鼠GFAP、β-actin單克隆抗體和二抗Goat Anti-Rabbit lgG H&L（HPR）（Abcam公司，英國(guó)）;紅外線熒光二抗Anti-rabbit IgG（H+L）（CST公司，美國(guó)）;TBGreenTM Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）（Takara公司，日本）;Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（LI-COR公司，美國(guó)）;熒光PCR儀StePonePlus（Applied Biosystems，美國(guó)）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠32只（大鼠8W齡，體重180±20g），購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK 20090002）。動(dòng)物于通風(fēng)良好，溫度22～28℃，濕度為40%～60%，12小時(shí)光照/暗光的室內(nèi)條件下飼養(yǎng)。

1.3方法與步驟

購(gòu)買的動(dòng)物進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，將其隨機(jī)分成對(duì)照組、GSK'872對(duì)照組、錳中毒組、GSK'872干預(yù)組、每組8只;錳中毒組、GSK'872干預(yù)組大鼠經(jīng)腹腔注射（ip）MnCl2·4H20 （15mg/kg，每周5天，共4w）建立亞急性錳中毒模型。同時(shí)對(duì)照組、GSK'872對(duì)照組腹腔注射等容量生理鹽水。動(dòng)物在進(jìn)行腹腔染錳期間，GSK'872干組、GSK'872對(duì)照組于每周的第3日向小腦延髓池內(nèi)緩慢注射GSK'872，每次10 ul（25 mM，每周1天，共3w），錳中毒組和對(duì)照組則向小腦延髓池內(nèi)注射等量生理鹽水。最后剔除不合格的動(dòng)物，對(duì)照組剩余8只、GSK'872對(duì)照組剩余7只、錳中毒組剩余6只，GSK'872干預(yù)組剩余7只。錳及小腦延髓池注射藥物期間每日觀察大鼠一般情況、每周稱重2～3次并根據(jù)體重上下調(diào)整染錳劑量。

1.4樣本取材

小腦延髓池及腹腔染錳給藥4w結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)3w。取材：每組動(dòng)物取6只提取組織蛋白和RNA，動(dòng)物在深度麻醉下采用頸椎脫臼法處死取腦，分離雙側(cè)的腦海馬及黑質(zhì)組織，置于超低溫冰箱備用。

1.5樣本檢測(cè)

1.5.1Western blot檢測(cè)大鼠黑質(zhì)TH及海馬組織GFAP表達(dá)的變化。

腦組織添加高效RIPA組織裂解液，提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以計(jì)算上樣量。配制電泳凝膠進(jìn)行蛋白電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用1×TBST清洗后用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，置入一抗（GFAP 1：2 000，TH 1：2000 ，β-actin1：5 000）中室溫下孵育 4～6 h， 4 ℃過(guò)夜。次日1×TBST清洗后孵育二抗Anti-rabbit IgG（H+L）（1：30000）后，1×TBST清洗后在雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)中掃描，進(jìn)行免疫印跡觀察檢測(cè)，用Odyssey軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算各組GFAP、TH的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2 RT-qPCR法檢測(cè)海馬與黑質(zhì)RIP3基因的表達(dá)

用RNA總試劑盒提取皮層和海馬組織樣品RNA，并檢測(cè)RNA濃度和純度合格后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后進(jìn)行RT-qPCR法檢測(cè)海馬與黑質(zhì)RIP3基因的表達(dá)。重復(fù)3次以上實(shí)驗(yàn)，最后用Stepone Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct值表示。

2、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)資料采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。用x±s表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)量和基因表達(dá)量。各組間的均數(shù)差異以方差分析的最小顯著差異法（LSD）檢驗(yàn)，如方差不齊則選擇Tamhane’s T2 進(jìn)行校正檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05。

3、結(jié)果

3.1GSK'872對(duì)亞急性錳暴露大鼠海馬GFAP、黑質(zhì)TH表達(dá)的影響

（1）由表3-1，圖A，B可見，與對(duì)照組比較，染錳組大鼠GFAP蛋白表達(dá)水平升高（P < 0.05），TH表達(dá)水平降低;與染錳組比較，GSK'872干預(yù)組GFAP蛋白表達(dá)水平均降低（P< 0.05），TH表達(dá)水平降升高（P < 0.05）。

3.2 GSK'872對(duì)亞急性錳暴露大鼠海馬RIP3基因表達(dá)的影響

由表3-2可見，與對(duì)照組比較，染錳組大鼠海馬、黑質(zhì)RIP3表達(dá)水平均升高（P < 0.05）;與染錳中毒組比較，GSK'872干預(yù)組海馬RIP3表達(dá)水平均降低（P < 0.05）。

4、討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）在生理和病理?xiàng)l件下與神經(jīng)元的相互作用對(duì)大腦結(jié)構(gòu)和生理功能的維持均有著重要的影響作用，大腦錳最多富集于星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體內(nèi)并干擾其功能，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙[10，11]。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多不僅與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能受損有關(guān)，還可增強(qiáng)組織的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng) [12]，損害多巴胺能等神經(jīng)元的細(xì)胞代謝及功能。本研究的觀察到錳暴露后大鼠腦海馬的GFAP的表達(dá)隨即上調(diào)，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)合成功能障礙，這與多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。將GSK’872注入染錳大鼠的小腦延髓池后，海馬組織內(nèi)AS的反應(yīng)水平下降，多巴胺神經(jīng)元的TH表達(dá)明顯回升，同時(shí)染錳后海馬組織內(nèi)表達(dá)升高的RIP3、基因表達(dá)也有明顯下調(diào)，提示GSK’872可能具有一定拮抗錳神經(jīng)毒性的作用，其原因可能與GSK’872能特異性阻斷細(xì)胞的壞死樣凋亡的發(fā)生有關(guān)。

星形細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用在腦內(nèi)的生理平衡中十分重要，特別是通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)功能，如AS與神經(jīng)元之間的Gln-Glu-GABA循環(huán)（GGG循環(huán)）。AS的功能受損與過(guò)度活化在錳的神經(jīng)毒理機(jī)制中具有復(fù)雜多樣的作用。錳能誘導(dǎo)AS炎癥產(chǎn)物和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)的表達(dá)，增加一氧化氮（NO）底物、L-精氨酸在AS中的轉(zhuǎn)運(yùn)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的合成[13];活化的AS還能增加水通道蛋白aquaporin-4（aqp4）的表達(dá)，與錳介導(dǎo)的細(xì)胞腫脹有關(guān)[14]。與此同時(shí)，錳和多巴胺在腦內(nèi)的相互作用可增加多巴胺能細(xì)胞的受損程度。由于錳中毒誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死可因細(xì)胞裂解釋放出胞內(nèi)含物常引起炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)星形細(xì)胞與神經(jīng)元之間異常的相互作用，故在分子水平抑制細(xì)胞壞死的發(fā)生，理論上具有一定拮抗錳神經(jīng)毒性的作用，GSK’872在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出具有下調(diào)腦內(nèi)AS異常的活化水平、提高多巴胺能神經(jīng)元功能的作用。

近年來(lái)有關(guān)程序性細(xì)胞壞死機(jī)制在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用不斷受到關(guān)注。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)將GSK'872注入側(cè)腦室可減輕動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）模型動(dòng)物的腦水腫、減少腦海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死的，并降低促炎蛋白HMGB1的表達(dá);GSK'872可減輕MCAO模型大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞壞死的程度。應(yīng)用Necrostatin-1，GSK'872或MLKL抑制劑necrosulfonamide（NSA）或相應(yīng)基因的敲低能減輕連續(xù)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞的發(fā)生壞死性凋亡[16]。

綜上所述，錳中毒的引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞早期的活化水平升高及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙與壞死樣凋亡確有可能存在相關(guān)的關(guān)系，GSK’872能特異性抑制神經(jīng)組織細(xì)胞壞死樣凋亡，在一定程度上能減輕因細(xì)胞壞死引發(fā)神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)，降低組織的氧化應(yīng)激水平，它與其衍生物可能是一類預(yù)防和治療錳中毒等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在藥物。

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作者簡(jiǎn)介：何蓮瑜（1991.3-），女，壯族，廣西憑祥人，廣西醫(yī)科大學(xué)碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)毒理學(xué)。

通訊作者：鄧祥發(fā)。