黃芩苷抗哮喘作用與HMGB1/TLR4傳導通路的相關性研究

韓超 楊柳 張秋玲 梁慧玲 徐俊

摘要 目的：研究黃芩苷對支氣管哮喘防治的作用及其可能的作用機制。方法：將54只SD大鼠按體質量隨機分為正常組、哮喘模型組、地塞米松組及黃芩苷高、低劑量組。用卵清蛋白（OVA）誘發(fā)致敏大鼠建立支氣管哮喘的動物模型，給予相應藥物灌胃給藥4周，1次/d，其中正常組及哮喘模型組藥物以等量生理鹽水代替。用藥物干預性治療后，觀察各組藥物對大鼠的哮喘程度及哮喘潛伏期的影響。實驗結束后，24 h內處死大鼠，取材，測定并比較支氣管壁厚度、氣道上皮下膠原沉積程度;測定血中HMGB1濃度;免疫組織化學測定支氣管平滑肌中α-SMA和氣道組織TLR4的蛋白表達;RT-PCR法測定肺組織HMGB1 mRNA表達變化。結果：黃芩苷可明顯改善病鼠的哮喘程度，延長哮喘潛伏期（P<0.05～0.01）;可有效減輕病鼠支氣管管壁增厚及氣道上皮下膠原沉積程度（P<0.05）;明顯降低血漿中HMGB1的含量，肺組織中的HMGB1 mRNA表達呈下降趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）;可明顯降低氣道組織中的TLR4，氣管平滑肌中α-SMA的蛋白表達及TLR4 mRNA的表達水平（P>0.05）。結論：黃芩苷具有抗哮喘作用，其作用可能與其影響HMGB1/TLR4通路的信號傳導相關。

關鍵詞 黃芩苷;哮喘;地塞米松;哮喘潛伏期;傳導通路;大鼠

Abstract Objective：To study the effects of Baicalin on prevention and treatment of bronchial asthma and its possible mechanism.Methods：A total of 54 SD rats were randomly divided into a normall group，an asthma model group，a dexamethasone group，baicalin high and low dose groups by weight.Animal model of bronchial asthma was induced by ovalbumin （OVA）.The corresponding drugs were given by orally intragastric administration once a day for 4 weeks.The normal group and the asthma model group were replaced by same volume of normal saline （NS）.The effects on asthmatic degree and the latent period of asthma of each rats group were observed after treatment.After the experiment，the rats were killed within 24 h for collection of materials.The thickness of bronchial wall，the degree of collagen deposition in airway，the concentration of HMGB1 in blood，the expression of α-SMA in bronchial smooth muscle and TLR4 in airway were measured by immunohistochemistry.The expression of HMGB1 mRNA in lung tissue was determined by RT-PCR method.Results：Baicalin high and low dose groups could obviously improve the asthmatic degree and prolong the latent period of asthma （P<0.05-0.01），and could effectively reduce the thickness of bronchial wall and the degree of subcutaneous collagen deposition in airway （P<0.05）.The content of HMGB1 in plasma was significantly decreased，and the expression of HMGB1 mRNA in lung tissue was decreased，but there was no significant difference （P>0.05）.The protein expression of α-SMA and TLR4，the expression of TLR4 mRNA in tracheal smooth muscle were significantly decreased （P>0.05）.Conclusion：Baicalin has an effect of anti-asthmatic，which may be related to its influence on signal transduction of the HMGB1/TLR4 pathway.

Key Words Baicalin;Asthma;Dexamethasone;Asthma latency;Conduction pathway;Rat

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.012

黃芩苷（Baicalin）是植物黃芩的主要有效成分之一，具有清熱解毒、抗炎、抗變態(tài)反應等多方面的藥理作用[1]。近年來隨著國內外對黃芩苷研究的不斷深入，其越來越多的作用如抗氧化、免疫調節(jié)、促細胞凋亡等多作用被發(fā)現。高遷移族蛋白B1（High Mobility Group Box 1，HMGB1）是一種高度保守的核蛋白，為重要的內源性炎性反應遞質，既是早期炎性反應的觸發(fā)因子，又是晚期炎性反應的啟動因子[2]。研究[3]已表明Toll樣受體4（Toll Like Receptors 4）是HMGB1促炎過程中的重要受體之一。現已有大量研究證實[4-7]，HMGB1/TLR4信號通路在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，故對HMGB1/TLR4通路表達進行調控有望成為防治哮喘的新手段。本實驗通過觀察黃芩苷灌胃給藥后對大鼠哮喘的改善作用，并探討其對氣道重塑的抑制作用及與HMGB1/TLR4信號通路的相關性，為防治哮喘氣道重塑提供一個研究思路及新的干預方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康的SPF級SD大鼠54只，雌性，體質量150～180 g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心購入，實驗動物生產許可證：SCXK（粵）2013-0002;暨南大學實驗動物中心飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SCXK（粵）2012-0117。飼養(yǎng)條件為：溫度20～26 ℃，濕度40%～70 %;給予常規(guī)飼料喂食，自由飲水。

1.1.2 藥品 黃芩苷，西安藻露堂藥業(yè)集團康復醫(yī)藥有限公司，純度85%，批號：110715-201016;卵清蛋白（OVA），Sigma公司生產，產品批號：A5253）;醋酸地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司生產，批號：140692。

1.1.3 試劑與儀器 TLR4抗體，英國Abcam公司生產，批號：GR199098-6;HMGB1 ELISA試劑盒，武漢華美有限公司生產，批號：U13011773;Masson染色試劑盒，武漢谷歌生物科技生產，批號：G1005。超聲霧化器，魚躍醫(yī)療設備股份有限公司產品，型號402AI;凝膠電泳、電轉儀，美國Bio-RAD公司產品;高速冷凍離心機，美國Thermo Sorvall公司產品，型號ST16R;顯微鏡，意大利OPTIKA公司產品，型號M-114。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照體質量將54只大鼠隨機分為正常組、哮喘模型組、地塞米松干預組（2.7×104 mg/kg）和黃芩高、低劑量干預組（0.32、0.08 g/kg）。哮喘動物模型參照文獻制備[8]：哮喘模型組、藥物干預組大鼠分別于第1、8和15天腹腔注射OVA致敏液0.1 mL/只[含OVA 100 mg、Al（OH）3干粉100 mg，NaCl 1 mL]致敏，正常組用生理鹽水代替。

1.2.2 給藥方法 第15天開始，哮喘模型組、藥物干預組每只大鼠用超聲霧化機霧化吸入1% OVA進行哮喘激發(fā)，0.5 h/次，1次/d，連續(xù)霧化激發(fā)2周，共計14次;正常組以等量生理鹽水霧化吸入。從致敏次日起，灌胃給予各組大鼠相應藥物，自第15天起于霧化激發(fā)前0.5 h給藥（其中地塞米松組隔天給藥）。

1.2.3 檢測指標與方法

1）哮喘引喘期及喘息程度的測定：于激發(fā)的第1、8、14天，末次給藥后0.5 h按上法對大鼠進行引喘，記錄大鼠從激發(fā)開始至出現喘促、腹肌痙攣等癥狀的時間。從第15天進行激發(fā)哮喘開始，參照文獻[9-10]根據大鼠喘息癥狀的程度進行評分。

2）肺、氣道組織標本制備和HE、Masson及免疫組化染色：末次霧化激發(fā)后，各組大鼠均在24 h內取材。每只大鼠腹腔注射給予戊巴比妥鈉麻醉（劑量為60 mg/kg），經腹主動脈采集約2～3 mL血樣，注入肝素抗凝管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存，用于ELISA檢測。取血后打開大鼠胸腔，取左肺組織-80 ℃保存，用于實時定量PCR檢測。取右肺上、中葉，石蠟包埋固定，常規(guī)切片，分別進行HE、Masson及免疫組織化學染色。對HE及Masson染色切片進行顯微圖像采集分析，觀察大鼠支氣管壁厚度和支氣管上皮下膠原沉積情況;對免疫組化染色肺組織，評估支氣管平滑肌厚度。再小心分離頸部氣管，剪取咽至肺之間的氣道部分，每組隨機選取3份常規(guī)石蠟包埋固定，用于免疫組織化學染色，其余于-80 ℃保存，待測。

3）免疫組織化學法測定氣道組織中TLR4蛋白表達水平：將已固定24 h的大鼠氣道組織進行包埋、切片、脫蠟后依次滴加TLR4一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗、DBA顯色、蘇木素復染、脫水封片，然后進行免疫組化測定，觀察大鼠氣道組織陽性細胞中TLR4蛋白的表達。每張切片隨機選取6個高倍視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件，測量IOD值，以此代表陽性蛋白表達程度。

4）Real-Time PCR檢測HMGB1及TLR4 mRNA 表達水平：按照Trizol方法分別測定肺及支氣管組織中的目標總RNA表達水平。引物序列見表1。PCR反應條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。融解曲線：65 ℃ 30 s。每個樣品重復3次，擴增結束，記錄Ct值，按照2-△△Ct方法對檢測結果進行統計分析，結果用2-△△Ct均值±標準差（±s）表達。

5）ELISA法測定大鼠血漿中HMGB1的含量：按照ELISA試劑盒操作方法說明書進行檢測。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用雙尾不配對t檢驗（Student′s test），各組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷對哮喘大鼠引喘期及哮喘程度評分的影響 大鼠用OVA誘發(fā)哮喘后，哮喘模型組大鼠隨即表現出明顯的哮喘癥狀，哮喘潛伏期隨著激發(fā)天數增加而逐漸縮短。結果顯示，給藥后地塞米松組，黃芩苷高、低劑量組均可明顯減輕病鼠的哮喘癥狀，且隨給藥時間的延長，藥物組大鼠的哮喘潛伏期也隨之延長。實驗第15 d，各藥物組大鼠的哮喘潛伏期均較哮喘模型組明顯延長（P<0.05），且黃芩苷組與地塞米松組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2 黃芩苷對哮喘大鼠氣道平滑肌的影響 大鼠肺組織HE染色結果顯示，哮喘模型組支氣管壁厚度較正常組明顯增厚。Masson染色結果顯示，氣道上皮下膠原沉積明顯增多，支氣管平滑肌厚度明顯增加（P<0.05）;與哮喘模型組比較，黃芩苷高、低劑量組均可減輕支氣管管壁增厚和氣道上皮下膠原沉積程度及減緩大鼠氣道平滑肌增生（P<0.05）。見圖1-3、表3。

2.3 黃芩苷對哮喘大鼠血中HMGB1含量及肺、氣道組織中HMGB1mRNA、TLR4 mRNA表達水平的影響 哮喘模型組血中HMGB1含量明顯比正常組升高（P<0.05）;與哮喘模型組比較，地塞米松、黃芩苷高劑量組、低劑量組均可明顯降低血漿HMGB1含量（P<0.05）。哮喘模型組氣道組織中的TLR4蛋白陽性表達，TLR-4 mRNA及肺組織中的HMGB1 mRNA表達量比正常組升高（P<0.05）;與哮喘模型組比較，地塞米松組、黃芩苷高、低劑量組的HMGB1 mRNA較哮喘模型組均有一定下降趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。氣道組織TLR4 蛋白表達水平和TLR-4 mRNA水平則明顯降低（P<0.05）。見圖4、表4。

3 討論

支氣管哮喘是一種以氣道炎性反應細胞浸潤、炎性反應細胞增多、氣道重塑（Airway Remodeling，AR）為重要特征的常見呼吸道慢性炎癥性疾病，有學者[11]認為AR與氣道炎性反應可能并行存在，并導致慢性炎性反應的發(fā)生及持續(xù)。眾所周知，AR是哮喘的重要病理特征之一。研究表明[12]，AR不僅在哮喘的晚期出現，也出現在哮喘的早期，對AR的研究將有利于早期防治哮喘的發(fā)生、發(fā)展，但目前臨床通用的哮喘診治方案，重點均放在氣道炎性反應的控制方面，而對AR的防治不夠重視，因此目前對加強防治哮喘AR藥物的研究的呼聲也越來越大。

黃芩為我國傳統中藥，臨床應用歷史悠久。黃芩苷是其主要活性成分之一，經研究證實有著抗炎、調節(jié)免疫、抗病毒等多種藥理活性[1]。近年來，關于黃芩苷在哮喘防治方面的作用已引起學者們的關注，相關研究也不斷增加，但其對哮喘作用機制尚不明確。目前已有研究證實，黃芩苷可明顯減輕哮喘豚鼠的肺部炎性反應及減緩和阻止哮喘大鼠的AR[13-14]，對過敏性哮喘小鼠失衡的Th1/Th2也有著有良好的調節(jié)作用[15-16]。本研究發(fā)現，大鼠經OVA霧化激發(fā)后，哮喘模型組大鼠即出現明顯的哮喘癥狀。給予藥物干預后，各藥物組大鼠的哮喘癥狀均得到顯著改善;哮喘潛伏期亦隨著給藥時間的延長而明顯延長，至給藥第2周末，黃芩組對哮喘引喘期的效果已與地塞米松組相當。由此可證明，黃芩苷對由OVA誘發(fā)的大鼠哮喘模型氣道痙攣具有良好的保護作用。

α-SMA是氣道平滑肌的主要標志物，具有很強的膠原合成和收縮能力，觀察α-SMA的表達水平可評估平滑肌細胞的數量及其收縮功能的變化，氣道平滑肌收縮時可致支氣管管腔狹窄而誘發(fā)哮喘。α-SMA表達水平的增加，與哮喘的發(fā)作及哮喘AR可能有著密切的關系。我們實驗中病鼠的肺組織HE、Masson染色及α-SMA免疫組化染色分析結果均顯示，黃芩苷組均可有效減輕氣道炎性反應，改善氣道管壁增厚和上皮下膠原沉積程度，減緩病鼠氣道平滑肌增生。

HMGB1作為一種免疫調節(jié)因子和炎性因子參與了氣道炎性反應的發(fā)生和發(fā)展。TLR4已被證實是一種重要的免疫識別受體，可連接天然和獲得性免疫，在引起和調節(jié)支氣管氣道炎性反應過程中發(fā)揮了重要作用。研究[17-18]已證實：TLR4是HMGB1促炎過程中的重要受體，并在HMGB1的信號傳導過程中發(fā)揮了重要作用。HMGB1在與TLR4結合過程中相互作用，并由此引起下游炎性反應遞質的釋放，炎性反應遞質與HMGB1又相互誘導激活，從而形成惡性循環(huán)，引發(fā)炎性反應的級聯效應，使炎性反應逐級放大[17]。已有動物研究證實，哮喘時支氣管氣道上皮細胞和炎性細胞中的HMGB1呈高表達，哮喘小鼠肺組織中的HMGB1和TLR4從基因及蛋白水平的表達均呈顯著增加[19]。在本實驗中，我們通過OVA誘導制備了哮喘大鼠模型，通過ELISA、免疫組化染色、PCR等方法，得出的結果與文獻報道基本一致：哮喘模型組大鼠血漿中的HMGB1含量、肺組織中的HMGB1 mRNA、氣道組織中的TLR4蛋白及TLR4 mRNA表達均顯著升高。用藥干預后，各藥物組均可明顯降低病鼠血漿中的HMGB1含量，氣道組織細胞中的TLR4蛋白表達和TLR4 mRNA表達水平也明顯下降，但肺組織中的HMGB1 mRNA的表達水平雖較哮喘模型組下降，但差異無統計學意義。

本實驗結果進一步確認了HMBG1/TLR4信號傳導通路可能與哮喘氣道炎性反應及AR的發(fā)生、過程密切相關，與研究文獻報道一致。黃芩苷的干預性治療可有效減輕哮喘大鼠氣道炎性反應，還可改善哮喘大鼠的AR，這一作用可能與其對HMBG1/TLR4信號通路的調控相關。黃芩苷可能作用于HMGB1-TLR4信號通路，影響其信號傳導，抑制下游炎性反應遞質的釋放，阻斷炎性反應的級聯效應，從而發(fā)揮抗哮喘的作用。同時，我們也發(fā)現，除黃芩苷高劑量組外，其他藥物組均能明顯下調HMGB1 mRNA的表達量，但與哮喘模型組比較，差異均無統計學意義，這一結果可能因檢測的標品量不足夠大、數據標準差大、結果分布離散所導致。此外，從本實驗結果可以發(fā)現，黃芩苷高、低劑量組在對哮喘大鼠的指標改善作用方面并無明顯差異，我們推斷黃芩苷治療哮喘的作用與劑量可能并無依賴關系，提示以后在做相關研究時，須注意黃芩苷的有效濃度的選擇。

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（2019-04-23收稿 責任編輯：芮莉莉）