花葉金線蓮離體保存技術(shù)研究

陳藝荃　樊榮輝　葉秀仙

摘要：采用緩慢生長(zhǎng)保存法對(duì)花葉金線蓮進(jìn)行離體保存試驗(yàn)。結(jié)果表明：在培養(yǎng)溫度（24±3）℃，光照強(qiáng)度前3個(gè)月1500～2000 lx、3個(gè)月后500～1000 lx，光照時(shí)間10 h·d-1的培養(yǎng)條件下，花葉金線蓮單芽在改良MS+蔗糖20 g·L-1+甘露醇20 g·L-1培養(yǎng)基中保存12個(gè)月，存活率達(dá)85.0%，保存后能恢復(fù)正常生長(zhǎng);緩慢生長(zhǎng)保存法可為金線蓮種質(zhì)保存提供新的方法與思路。

關(guān)鍵詞：花葉金線蓮;緩慢生長(zhǎng);離體保存

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.06.006

Abstract： The method of slow growth conservation was used to conduct the experiment of in vitro conservation of mosaic anoectochilus formosanus. The results showed that： In the culture conditions of the temperature being 24±3℃， the illumination intensity being 1500-2000 lx for the first 3 months and 500-1000 lx after 3 months， and the illumination time being 10 h·d-1， the survival rate of the single bud of mosaic anoectochilus formosanus reached 85.0% after 12 months conservation in the modified MS+sucrose 20 g·L-1+ mannitol 20 g·L-1 medium. And it could restore normal growth after the conservation， which provided a new method and idea for the germplasm conservation of anoectochilus formosanus.

Key words： Mosaic anoectochilus formosanus;Slow growth;In vitro conservation

金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材，也是十分珍貴的室內(nèi)小型觀葉植物[1-4]?；ㄈ~金線蓮系金線蓮?fù)蛔冏杂缕贩N，因其葉色墨綠色與金黃色相嵌，形成鮮明的色彩對(duì)比，色澤亮麗，極具觀賞價(jià)值，其既可作為藥用兼觀賞的新品種開發(fā)，又可作為試管花卉的工藝品開發(fā)應(yīng)用。作為一種新型草本蘭科植物，同其他蘭花資源一樣，主要是采用田間種植保存和組織培養(yǎng)保存，但金線蓮種植保存過(guò)程中易受氣候條件限制，尤其高溫高濕環(huán)境條件下，莖腐病等病害為害嚴(yán)重，使活體保存工作難于開展，而組織培養(yǎng)保存需對(duì)種質(zhì)材料進(jìn)行頻繁繼代，工作量大、成本高，且可能會(huì)發(fā)生變異等問(wèn)題。因此，研究探索一套符合金線蓮特點(diǎn)的種質(zhì)資源保存方法十分必要。

緩慢生長(zhǎng)離體保存是近年來(lái)新發(fā)展且較為有效的種質(zhì)保存方法，是以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)改變培養(yǎng)條件，如在培養(yǎng)基中加入化學(xué)物質(zhì)或采用一些物理方法，限制或延緩培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，使組織或細(xì)胞生長(zhǎng)降至最小限度，但不死亡或者少量死亡，從而達(dá)到延長(zhǎng)繼代培養(yǎng)的保存方法。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以使保存材料維持不斷生長(zhǎng)。影響緩慢生長(zhǎng)離體保存效果的因素很多，但主要因素是培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件。通過(guò)在保存培養(yǎng)基中添加不同濃度蔗糖、甘露醇、脫落酸、多效唑等對(duì)種質(zhì)離體保存影響的研究，近年來(lái)，本課題組在文心蘭、蝴蝶蘭等蘭科植物離體種質(zhì)保存中有較多的實(shí)踐[5-7]。目前未見花葉金線蓮種質(zhì)資源離體保存技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。本研究利用課題組已建立的花葉金線蓮的離體培養(yǎng)再生體系[8]，研究了改良MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度蔗糖及甘露醇對(duì)花葉金線蓮單芽離體保存的影響，以期為金線蓮種質(zhì)資源保存提供理論和技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以花葉金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.‘Huaye’單芽為離體保存試驗(yàn)材料。試驗(yàn)在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2離體保存方法

陳藝荃等：花葉金線蓮離體保存技術(shù)研究2019年第6期2019年第6期陳藝荃等：花葉金線蓮離體保存技術(shù)研究在改良MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度（10、20、30、40、50、60、70 g·L-1）蔗糖，以及添加不同濃度（10、20、30、50 g·L-1）甘露醇。其中改良MS基本培養(yǎng)基組分詳見表1，甘露醇處理中均附加蔗糖20 g·L-1。以上每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種4株單芽，瓶口用保鮮膜封口。每2個(gè)月調(diào)查1次存活率（存活率為存活株數(shù)與接種株數(shù)的比值×100%），不更換培養(yǎng)基連續(xù)保存12個(gè)月。每個(gè)月觀察其生長(zhǎng)情況和存活率。以上試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1.3保存材料的恢復(fù)生長(zhǎng)

試管苗保存12個(gè)月，與60 d繼代1次正常培養(yǎng)的對(duì)照試管苗各自轉(zhuǎn)接到恢復(fù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基（表2）中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（24±3）℃，光強(qiáng)為1500～2000 lx，光照時(shí)間為10 h·d-1。

2結(jié)果與分析

2.1蔗糖對(duì)花葉金線蓮單芽保存的影響

將花葉金線蓮單芽接種在添加不同濃度蔗糖的改良MS培養(yǎng)基上保存，保存結(jié)果見表3。

表3結(jié)果表明，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，花葉金線蓮單芽存活率隨蔗糖濃度的增加而降低;培養(yǎng)基中添加低濃度蔗糖20 g·L-1，在緩慢生長(zhǎng)保存12個(gè)月后仍保持較高的存活率，達(dá)80.0%。說(shuō)明降低培養(yǎng)基中的蔗糖濃度具有減緩生長(zhǎng)，延長(zhǎng)保存時(shí)間的作用，而高濃度蔗糖可能增加了培養(yǎng)基的滲透壓，使植株吸收水分和養(yǎng)分嚴(yán)重受阻，導(dǎo)致生長(zhǎng)不良死亡。

2.2甘露醇對(duì)花葉金線蓮單芽保存的影響

將花葉金線蓮單芽接種在添加不同濃度甘露醇的改良MS附加蔗糖20 g·L-1培養(yǎng)基上保存，保存結(jié)果見表4。

表4結(jié)果表明，在添加不同濃度甘露醇的培養(yǎng)基上，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，添加一定濃度的甘露醇對(duì)花葉金線蓮單芽保存有利，能有效提高其存活率。篩選出適宜花葉金線蓮保存的甘露醇濃度為20 g·L-1，保存12個(gè)月存活率達(dá)85.0%。

綜上，適宜花葉金線蓮單芽保存的培養(yǎng)基為改良MS+蔗糖20 g·L-1+甘露醇20 g·L-1。

2.3保存材料的恢復(fù)生長(zhǎng)

經(jīng)保存的材料，切去根系，將莖段轉(zhuǎn)接到花葉金線蓮專用恢復(fù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)情況與正常繼代苗無(wú)明顯差異，保存苗均能生根成完整植株?？梢姡谄胀ńM織培養(yǎng)條件下，保存花葉金線蓮試管苗，材料受損傷程度較小，不需長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù)。

3結(jié)論與討論

緩慢生長(zhǎng)離體保存最大優(yōu)點(diǎn)是使保存材料維持不斷生長(zhǎng)。影響其保存效果的因素很多，但主要是培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件。蔗糖具有雙重作用，不僅為試管苗的生長(zhǎng)發(fā)育提供主要碳源，而且作為一種高滲化合物，起到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透勢(shì)的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加20 g·L-1蔗糖對(duì)花葉金線蓮單芽保存效果最好，能夠有效延長(zhǎng)繼代間隔時(shí)間，保存12個(gè)月的存活率達(dá)80.0%。

在離體種質(zhì)保存中，培養(yǎng)基中加入一定濃度的甘露醇可減緩植株生長(zhǎng)，延長(zhǎng)保存時(shí)間。甘露醇作用機(jī)理是降低了細(xì)胞膨壓，提高了培養(yǎng)基的滲透勢(shì)負(fù)值，造成水分逆境，使水分和養(yǎng)分吸收受阻，減少營(yíng)養(yǎng)消耗;同時(shí)細(xì)胞壁酶活性受到抑制，減弱新陳代謝活動(dòng)，延緩細(xì)胞生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加甘露醇20 g·L-1，對(duì)花葉金線蓮單芽保存效果最好，能夠有效延長(zhǎng)繼代間隔時(shí)間，保存12個(gè)月的存活率達(dá)85.0%，且恢復(fù)生長(zhǎng)與正常繼代苗表現(xiàn)無(wú)明顯差異。

花葉金線蓮?fù)ㄟ^(guò)限制生長(zhǎng)法保存，保存12個(gè)月期間不需要轉(zhuǎn)接繼代，與常規(guī)的組織培養(yǎng)保存（2個(gè)月繼代1次）相比，不僅延長(zhǎng)了保存材料的繼代間隔期，避免頻繁繼代，節(jié)約培養(yǎng)成本，而且材料一直處于生長(zhǎng)狀態(tài)，可以保持種質(zhì)優(yōu)良特性，隨時(shí)用于擴(kuò)繁。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）