不同pH對特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的影響

馬甜 龔含情 陳建波 羅永婷

摘要：本文研究了在2.0、3.5、4.5、7.4、8.8五種pH值條件下特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用。結果表明：pH值為7.4（即生理條件下）時，結合常數(shù)K出現(xiàn)最大值，由此可見pH7.4是特拉匹韋與人血清白蛋白相互作用的最適pH值。

關鍵詞：特拉匹韋;人血清白蛋白;pH

【中圖分類號】R-01 ???【文獻標識碼】A ???【文章編號】2107-2306（2019）06-074-02

1 引言

血清白蛋白（Serum ?albumin，SA）作為脊椎動物血漿中含量最豐富的蛋白質，是血液系統(tǒng)的重要組成部分，它具有結合與運輸內源性物質、維持血液膠體滲透壓及物質交換、 自由基清除、抗凝血及抑制血小板功能、影響微管滲透性等生理功能。

特拉匹韋是治療慢性丙型肝炎病毒感染的一個新大陸，能夠通過抑制NS3/4蛋白酶，攻擊HCV來阻斷病毒復制，在體內和體外都有抗HCV基因的活性。目前，特拉匹韋已經成為一個能夠對治療失敗的丙肝患者產生療效的藥物，它的安全性高、用藥時間短，能夠減少長期用藥帶來的不良反應。

本文探討了人血清白蛋白 （Human serum albumin， HSA） 在不同pH環(huán)境下與特拉匹韋的結合情況，比較了不同pH環(huán)境對二者結合程度的影響，提出理論最適pH條件，為特拉匹韋在臨床的研究提供參考。

2 實驗部分

2.1試劑與儀器

人血清白蛋白（純度≥98.0%，上海源聚生物科技有限公司產品），特拉匹韋（純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司產品），氯化鈉，氫氧化鈉，Tris，鹽酸均為分析純試劑。

ZD-2pH計，DK-S24電熱恒溫水浴鍋，Cary Eclipse熒光分光光度計，AL104電子分析天平。

2.2實驗方法

用Tris和鹽酸配成濃度為0.05mol/L、pH分別為2.0、3.5、4.5、7.4、8.8的 Tris-鹽酸緩沖液，其中，用濃度為0.1mol/L的氯化鈉維持溶液離子強度。用配制好的不同的pH緩沖液分別配制人血清白蛋白與特拉匹韋濃度比依次升高的溶液，濃度比分別為1：0、1：5、1：9、1：13、1：17、1：21。將溶液置于298K的恒溫水浴鍋中放置一段時間后，取出進行熒光測定。熒光光譜的測定：設置激發(fā)波長為280nm，發(fā)射和激發(fā)狹縫為5nm，掃描300～500nm內蛋白的發(fā)射光譜。探究不同pH條件對特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用的影響。

3 結果與討論

3.1 pH7.4時特拉匹韋對人血清白蛋白熒光發(fā)射光譜的影響

5、9、13、17、21. ?T=298K， pH=7.4.

圖1顯示的是生理條件pH 7.4時的熒光光譜圖。隨著特拉匹韋濃度的增加，人血清白蛋白在最大熒光發(fā)射波長（λem） 341nm處的相對熒光強度有規(guī)律地降低，同時熒光峰位略有紅移，說明特拉匹韋對人血清白蛋白的熒光有猝滅作用， 且會使人血清白蛋白的疏水性減小，極性增加。二者存在著相互作用。

3.2不同pH條件下下特拉匹韋和人血清白蛋白的相互作用

本實驗選取分別在2.0、3.5、4.5、8.8四種pH環(huán)境，且溫度恒定為298K的條件下，通過pH對結合反應的影響的光譜圖來判斷不同pH值對特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的影響.圖2為不同pH條件下特拉匹韋與人血清白蛋白相互作用的熒光發(fā)射光譜圖。

（1） C（HSA）=1×10?mol/L ，（2-6）C （telaprevir） /C（HSA）：5、9、13、17、21.

由圖2可知，特拉匹韋與人血清白蛋白結合的熒光峰隨著pH條件的變化而略微移動，熒光強度也發(fā)生有所不同的變化，這說明，不同pH影響著特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用。

假設蛋白質與藥物相互作用存在單一結合位點的情況，應用方程（公式（1）），可計算特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的結合常數(shù)。

?

其中，F(xiàn)為人血清白蛋白的初始熒光強度（即未加特拉匹韋時蛋白的熒光強度）;F為特拉匹韋-人血清白蛋白體系的熒光強度;[Q]為特拉匹韋的最終體系濃度。根據(jù)對作圖，根據(jù)直線斜率可以求得特拉匹韋和人血清白蛋白的結合常數(shù)K。圖3為不同pH條件下特拉匹韋和人血清白蛋白結合位點的雙對數(shù)圖，根據(jù)圖中直線的斜率，由公式（1）計算求得結合常數(shù)K于表1中。

由表3數(shù)據(jù)可知，特拉匹韋與人血清白蛋白的結合可在不同pH環(huán)境下進行，結合常數(shù)隨pH值的變化而發(fā)生改變，這是可能是因為不同的pH值環(huán)境影響了蛋白自身的構象，或者影響了特拉匹韋與蛋白質帶電的情況。同時，由表1數(shù)據(jù)可知，當pH為7.4時，特拉匹韋與人血清白蛋白結合常數(shù)最大，這說明，pH7.4是特拉匹韋與人血清白蛋白結合的最適pH，也即生理環(huán)境的pH是特拉匹韋與人血清白蛋白結合的最適pH。

4 結論

本文運用熒光光譜法研究了特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用。求出特拉匹韋和人血清白蛋白的結合常數(shù)，直觀反應并探討了不同pH值對特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的影響。由表中數(shù)據(jù)可知，特拉匹韋和人血清白蛋白的結合常數(shù)較大，說明兩者有較強的結合作用。推測人血清白蛋白起到儲存和運輸特拉匹韋的作用，并且參與機體的血液循環(huán)至作用部位。

結果發(fā)現(xiàn)不同pH值條件下，特拉匹韋均能與人血清白蛋白結合，但結合常數(shù)不同，這可能是因為蛋白質在不同pH值條件下的分子構象發(fā)生了改變或由于不同pH值下，特拉匹韋的解離度相同引起蛋白質帶電不同進而可能影響到反應的結合常數(shù)。在四種pH值條件下，pH值為7.4（即生理條件下）時，結合常數(shù)Ka出現(xiàn)最大值，由此表明pH 7.4是特拉匹韋和與人血清白蛋白相互作用的最適pH值。實驗結果可對特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的作用機理研究、臨床研究和生物工程等領域提供重要的理論參考。

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基金項目：國家自然科學基金項目（21303105）資助