養(yǎng)腦寧心顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙銳 張麗

摘要 目的：建立養(yǎng)腦寧心顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：選取薄層色譜法方法養(yǎng)腦寧心顆粒處方中牡丹皮、山茱萸、枸杞子進(jìn)行定性鑒別;用高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)腦寧心顆粒中葛根指標(biāo)性成分葛根素的含量。結(jié)果：在薄層色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜圖相應(yīng)的位置上，可見相同顏色的牡丹皮、山茱萸、枸杞子熒光斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng);葛根素進(jìn)樣量0.23～1.15 μg，呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 9，平均回收率：98.5%，RSD為0.81%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性良好，可作為養(yǎng)腦寧心顆粒制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞 養(yǎng)腦寧心顆粒;葛根;葛根素;牡丹皮;山茱萸;枸杞子;薄層色譜法;高效液相色譜法

Abstract Objective：To establish the quality standard of Yangnao Ningxin Granules.Methods：TLC method was used to qualitatively identify the Cortex Moutan Radicis，F(xiàn)ructus Corni and Fructus Lycii in the prescription.The content of puerarin in peony was determined by HPLC.Results：In the thin-layer chromatogram，the corresponding spots of the corresponding color of the Cortex Moutan Radicis，F(xiàn)ructus Corni and Fructus Lycii spots correspond to the same color; the puerarin injection volume was 0.23～1.15 μg，showing a good linear relationship（r=0.999 9），average recovery：98.5%，RSD 0.81%.Conclusion：The method is simple，easy to repeat，and can be used as a quality control standard for the preparation.

Key Words Yangnao Ningxin Granule; Radix Puerariae; Puerarin; Cortex Moutan Radicis; Fructus Corni; Fructus Lycii; TLC; HPLC

中圖分類號(hào)：R289.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.007

養(yǎng)腦寧心顆粒由葛根、山茱萸、牡丹皮、枸杞子、甘草等多味中藥材組成，具有滋養(yǎng)心腎、安神定志的功效，臨床上主要用于心腎陰虛型頭暈耳鳴、健忘失眠、腰膝酸軟等癥。方中熟地黃、山茱萸、枸杞子、麩炒山藥、白芍滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血益精、補(bǔ)脾益氣;茯苓、柏子仁養(yǎng)心安神、健脾;葛根、牡丹皮清熱涼血、生津止渴;配以甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥;全方共奏滋養(yǎng)心腎、安定神志之功效。方中以大量使用的葛根為君藥，葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，多于秋、冬二季采挖。味甘、辛，性涼。歸脾胃肺經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴，透疹，升陽(yáng)止瀉的功效，臨床多用于外感發(fā)熱、口渴、消渴等癥[1]，其主要成分為皂苷類、異黃酮類及三萜類，其中異黃酮類為葛根的主要活性成分，包括葛根素、3-羥基葛根素、葛根素-木糖苷、3-甲氧基葛根素等[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可明顯提高心肌細(xì)胞P9C2eNOS蛋白和基因表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮含量及其合酶表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，還可通過(guò)調(diào)節(jié)垂體后葉素的分泌，降低心律失常的發(fā)生[3-4]?，F(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)葛根素還具有解熱、鎮(zhèn)痛、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理作用[5-8]。

養(yǎng)腦寧心顆粒是陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心腦血管專家，以辨證論治為基礎(chǔ)，根據(jù)中醫(yī)藥理論，結(jié)合臨床實(shí)踐，總結(jié)多年的經(jīng)驗(yàn)組方。臨床使用療效顯著，不良反應(yīng)小，為適應(yīng)現(xiàn)代化發(fā)展及眾多患者的需求，我們將傳統(tǒng)的中藥湯劑進(jìn)行劑型改良，改良后的顆粒劑方便患者的攜帶和服用，也在一定程度上改善了該藥的口感，市場(chǎng)前景廣闊，具有開發(fā)意義。為了控制養(yǎng)腦性心顆粒的質(zhì)量，保證其療效，該試驗(yàn)從薄層色譜定性實(shí)驗(yàn)和高效液相色譜定量實(shí)驗(yàn)入手，探討該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而為臨床應(yīng)用提供可靠的試驗(yàn)資料和數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海光豪分析儀器有限公司），DYQC型醫(yī)用超聲波提取器（連云港歐倍潔醫(yī)療設(shè)備有限公司），十萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試劑 本實(shí)驗(yàn)中所用甲醇為色譜純，乙醇等化學(xué)試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 分析樣品 牡丹皮照藥材（批號(hào)121490-201102）、山茱萸對(duì)照藥材（批號(hào)121495-201303）、枸杞子照藥材（批號(hào)121072-201410）、葛根素（批號(hào)110752-201615）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。養(yǎng)腦寧心顆粒樣品（批號(hào)160426、160427、160428）由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 牡丹皮的薄層色譜鑒別 養(yǎng)腦寧心顆粒研細(xì)，準(zhǔn)確稱取粉末5.6 g，置于圓底燒瓶中，量取并加入乙醚50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液低溫?fù)]發(fā)干，精密量取正己烷0.5 mL使殘?jiān)芙?，即為供試品溶液。稱取牡丹皮對(duì)照藥材4.3 g，木香對(duì)照藥材溶液的制備方法同上。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502，精密吸取供試品溶液4 μL、木香對(duì)照藥材溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-丙酮-乙酸乙酯（84：15：1）為展開劑，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視[9-10]。供試品色譜中，可見相同顏色的斑點(diǎn)與對(duì)照藥材色譜的斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，且位置相同。見圖1。

2.1.2 山茱萸的薄層色譜鑒別 養(yǎng)腦寧心顆粒研細(xì)后，準(zhǔn)確稱取5.2 g粉末，置于具塞的錐形瓶中，量取并加入10 mL無(wú)水乙醇，放入超聲儀中15 min，濾過(guò)，濾液蒸干，精密量取2 mL無(wú)水乙醇使殘?jiān)芙?，即為供試品溶液。稱取山茱萸對(duì)照藥材2.8 g，山茱萸對(duì)照藥材溶液制備方法同上。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502，精密吸取供試品溶液、山茱萸對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸（50∶ 10∶ 1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴顯色劑5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中可見紫紅色的斑點(diǎn)與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)，且位置相同。見圖2。

2.1.3 枸杞子的薄層色譜鑒別 取適量養(yǎng)腦寧心顆粒研細(xì)，準(zhǔn)確稱取粉末5.4 g，置于燒瓶中，量取并加入35 mL水，煮沸15 min，放冷，濾液放于分液漏斗中，量取乙酸乙酯15 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，置水浴鍋上濃縮至1 mL，即為供試品溶液。稱取枸杞子對(duì)照藥材0.57 g，枸杞子對(duì)照藥材溶液制備方法同上。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502，精密吸取供試品溶液、枸杞子對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3：2：1）為展開劑。展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中可見相同顏色的斑點(diǎn)與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)，且位置相同。見圖3。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為：Angilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流動(dòng)相：甲醇-水（25：75），柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000[11-14]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品4.633 mg，置于100 mL容量瓶，30%乙醇溶液定容，制成每100 mL含4.633 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 養(yǎng)腦寧心顆粒研細(xì)，精密稱取粉末1.234 4 g，置于錐形瓶中，移液管移取50 mL的30%乙醇，加入錐形瓶，密塞，準(zhǔn)確稱量并記錄，放入超聲儀，30 min后取出，放涼，稱量并記錄，用30%乙醇補(bǔ)足此過(guò)程減少的重量，充分搖勻，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 精密量取葛根素對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，設(shè)定方法，測(cè)定，根據(jù)高效液相圖譜，陰性對(duì)照樣品在葛根素相對(duì)保留時(shí)間處未見色譜峰，結(jié)果顯示陰性樣品對(duì)該方法檢測(cè)幾乎無(wú)干擾。見圖4。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素對(duì)照品溶液（C=46 μg/mL）5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以葛根素對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出葛根素回歸方程Y=3 378.5X+23.745，r=0.999 9，結(jié)果表明葛根素對(duì)照品溶液進(jìn)樣量在0.23～1.15 μg，峰面積線性關(guān)系良好。見表1。

2.2.6 中間精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為161105的養(yǎng)腦寧心顆粒，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次精密吸取10 μL，按上述條件測(cè)定，葛根素峰面積的RSD：0.06%。見表2。

2.2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 養(yǎng)腦寧心顆粒批號(hào)161105的供試品溶液，精密移取5 μL，分別于0、4、8 h進(jìn)樣，測(cè)定養(yǎng)腦寧心顆粒中，葛根素的峰面積。葛根素峰面積RSD為0.26%，即養(yǎng)腦寧心顆粒供試品溶液穩(wěn)定性在8 h內(nèi)良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 養(yǎng)腦寧心顆粒批號(hào)161105的樣品，均勻分為6份，制備供試品溶液，每次精密量取10 μL，進(jìn)樣，測(cè)定，根據(jù)結(jié)果：葛根素平均含量為5.560 28 mg/g，RSD為1.97%。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為161105的養(yǎng)腦寧心顆粒樣品，均勻分為9份，已知葛根素5.602 8 mg/g，稱取樣品約1 g，6份養(yǎng)腦寧心顆粒樣品中精密加入一定量的葛根素對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算回收率，根據(jù)結(jié)果計(jì)算，平均回收率：98.50%，RSD：0.81%。見表3。

2.2.10 樣品測(cè)定結(jié)果 養(yǎng)腦寧心顆粒3批樣品，生產(chǎn)批號(hào)分別為161030、161105、161109，制成供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，用外標(biāo)法計(jì)算養(yǎng)腦寧心顆粒中葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。見表4。

根據(jù)3批養(yǎng)腦寧心顆粒含量測(cè)定的結(jié)果，暫定養(yǎng)腦寧心顆粒每袋含葛根以葛根素（C21H20O9）計(jì)，不得少于40 mg。

3 討論

3.1 提取溶劑濃度的確定 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)養(yǎng)腦寧心顆粒供試品溶液制備過(guò)程中，提取溶劑的濃度進(jìn)行了方法學(xué)的考察及驗(yàn)證，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：30%乙醇提取的養(yǎng)腦寧心顆粒供試品中葛根素的含量高于70%乙醇或甲醇作為提取溶劑，制備的養(yǎng)腦寧心顆粒供試品中葛根素的含量，故結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版1部，選定30%乙醇為該實(shí)驗(yàn)的提取溶劑[15-17]。

3.2 供試品溶液制備方法的確定 取養(yǎng)腦寧心顆粒適量，研細(xì)后，精密稱取1.237 8 g、1.400 5 g、1.302 7 g，分別放于圓底燒瓶及具塞的錐形瓶中，分別用移液管量取并加入30%乙醇50 mL，準(zhǔn)確稱量并記錄，圓底燒瓶放入水浴鍋加熱回流30 min、錐形瓶放入超聲儀，于超聲30 min、45 min后取出，放涼，分別稱量并記錄，用30%乙醇補(bǔ)足此過(guò)程減少的重量，充分搖勻，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。分別檢測(cè)3種提取方法制備的供試品中葛根素的含量。結(jié)果顯示，超聲30 min制備的養(yǎng)腦寧心顆粒供試品中葛根素的含量與超聲45 min、加熱回流30 min供試品中葛根素的含量幾乎相同，提示超聲30 min供試品中葛根素已完全提取，葛根素的含量并不隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，根據(jù)簡(jiǎn)便易行的原則，故選30%乙醇超聲30 min作為制備養(yǎng)腦寧心顆粒供試品的制備方法。

本實(shí)驗(yàn)從薄層色譜鑒別和含量檢測(cè)2方面入手，對(duì)處方中牡丹皮、山茱萸、枸杞子3味中藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，對(duì)處方中君藥葛根進(jìn)行指標(biāo)性成分葛根素含量的測(cè)定，從而建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高，結(jié)果穩(wěn)定，可用于同種劑型中藥制劑的質(zhì)量檢測(cè)。目前大多數(shù)中藥制劑主要從薄層色譜定性鑒別和高效液相色譜法含量檢測(cè)兩方面入手，選取制劑處方中的部分藥材進(jìn)行檢測(cè)，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

中藥制劑主要為復(fù)方制劑，以辨證論治為基礎(chǔ)，根據(jù)中醫(yī)藥理論組方而成，大多數(shù)的院內(nèi)制劑，為臨床使用的經(jīng)驗(yàn)方，長(zhǎng)期臨床應(yīng)用療效顯著，不良反應(yīng)小，深受患者的好評(píng)，但是傳統(tǒng)中藥以湯劑為主，其口感差，攜帶不便等缺點(diǎn)降低了患者服藥的依從性。隨著近年來(lái)中藥制劑的現(xiàn)代化發(fā)展及院內(nèi)制劑的開發(fā)，越來(lái)越多的經(jīng)方、驗(yàn)方被人們發(fā)掘出來(lái)，為了適應(yīng)現(xiàn)代化的發(fā)展及患者的服用及攜帶需求，中藥湯劑被逐漸改良為現(xiàn)代劑型，同時(shí)對(duì)中藥制劑的質(zhì)量要求也越來(lái)越高，為了確保其原有療效及臨床使用的安全性，運(yùn)用現(xiàn)代化技術(shù)探討并建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)中藥制劑中指標(biāo)性成分及其含量范圍，對(duì)確保中藥制劑的質(zhì)量及穩(wěn)定性生產(chǎn)具有重要意義。

養(yǎng)腦寧心顆粒由葛根、牡丹皮、山茱萸、枸杞子等10味中藥材配伍而成，其發(fā)揮的作用是處方中各味中藥材共同作用的結(jié)果，而且中藥成分復(fù)雜，為了更進(jìn)一步研究發(fā)揮作用的有效成分及物質(zhì)基礎(chǔ)，這就要求我們?cè)诮窈蟮脑囼?yàn)研究中，從處方中各味中藥材入手，根據(jù)中醫(yī)藥理論及藥物之間的配伍關(guān)系，運(yùn)用多種檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行研究，從而制定更完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為臨床安全使用提供可靠的數(shù)據(jù)和試驗(yàn)研究資料。

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（2018-05-10收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）