血府逐瘀湯對冠心病模型大鼠血管及心肌細胞凋亡的影響

常冰 李昌

摘要 目的：觀察血府逐瘀湯對冠心病模型大鼠的血管重塑效應(yīng)及對心肌細胞凋亡的影響。方法：將30只SD大鼠隨機分為空白組、模型組及干預(yù)組，每組10只。模型組及干預(yù)組大鼠接受高脂飼料喂養(yǎng)7周以制備冠心病模型，造模后中藥干預(yù)組大鼠接受血府逐瘀湯灌胃，模型組及空白組大鼠接受等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃4周，干預(yù)結(jié)束后測量3組大鼠心功能及冠狀動脈血流量，隨后將大鼠處死后取冠狀動脈及左心室組織，進行HE染色觀察冠狀動脈及左心室組織的病理學(xué)變化。采用Western blotting法測定PI3K、AKT、Bcl-2、Bax的表達差異。結(jié)果：1）與空白組比較，模型組LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax絕對值明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中干預(yù)組上述指標(biāo)較模型組高;2）與假手術(shù)大鼠心肌組織比較，模型組及干預(yù)組大鼠左心室心肌均出現(xiàn)明顯的病理損害征象;與模型組大鼠比較，干預(yù)組心肌組織受損程度明顯減輕;與空白組比較，模型組及干預(yù)組大鼠冠狀動脈內(nèi)中膜均出現(xiàn)明顯增厚，經(jīng)過血府逐瘀湯干預(yù)后的干預(yù)組大鼠動脈內(nèi)中膜厚度比值明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;3）Western blotting法檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，2組接受造模的大鼠心肌組織PI3K、Bcl-2表達降低，Bax升高，血府逐瘀湯可上調(diào)PI3K及AKT的磷酸化程度，提高了Bcl-2表達，抑制了Bax的水平。結(jié)論：血府逐瘀湯有抑制冠心病模型大鼠血管重塑及保護心臟的效應(yīng)，其作用機制可能與介導(dǎo)PI3K-AKT信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 冠心病模型;大鼠;血管重塑;心肌保護;凋亡;PI3K-AKT信號通路;作用機制

Abstract Objective：To observe the effects of Xuefu Zhuyu Decoction on vascular remodeling and cardiomyocyte apoptosis in coronary heart disease model rats.Methods：A total of 30 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group and intervention group，with 10 rats in each group.Rats in the model group and intervention group were fed with high-fat diet for 7 weeks to prepare coronary heart disease model.Rats in the intervention group received Xuefu Zhuyu Decoction by gavage.Rats in the model group and the sham operation group received the same dose of normal saline by gavage for 4 weeks.After the intervention，cardiac function and coronary blood flow were measured in each group of rats，and the coronary artery and left ventricular tissue were taken after the rats were killed.Pathological changes of the coronary artery and left ventricular tissue were observed by HE staining.Expressions of PI3K，AKT，Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting.Results： 1）Compared with the sham operation group，the absolute values of LVSP，-dp/dtmax and+dp/dtmax in the model group were decreased obviously，with statistical significance（P<0.05），in which the above indexes in the intervention group were up-regulated compared with those in the model group. 2）The left ventricular myocardium in the model group and the intervention group showed obvious pathological changes compared with that in the sham operation group.Compared with the model group，the damage degree of myocardial tissue in the intervention group was significantly reduced; compared with the sham operation group，the intima-media thickness of coronary artery in the model group and the intervention group was significantly thickened.After the intervention of Xuefu Zhuyu Decoction，the ratio of intima-media thickness of the artery in the intervention group was significantly lower than that in the model group，and the difference was statistically significant（P<0.05）. 3）Western blotting showed：compared with the sham operation group，the expressions of PI3K and Bcl-2 in the myocardial tissue of rats in the other 2 groups underwent modeling were decreased，while the expression of Bax was increased.Xuefu Zhuyu Decoction could up-regulate the phosphorylation of PI3K and AKT，up-regulate the expression of Bcl-2，and inhibit the level of Bax.Conclusion：Xuefu Zhuyu Decoction has the effect of inhibiting vascular remodeling and protecting the heart in coronary heart disease model rats，and its mechanism may be related to mediating the PI3K-AKT signaling pathway.

Key Words Coronary heart disease model; Rat; Vascular remodeling; Myocardial protection; Apoptosis; PI3K-AKT signaling pathway; Mechanism

中圖分類號：R542.2;R965.1文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.019

冠心?。–oronary Heart Disease，CHD）指的是冠狀動脈粥樣硬化后導(dǎo)致冠脈管腔狹窄以及順應(yīng)性改變，導(dǎo)致冠狀動脈供血不足，由此引起心肌缺血、缺氧改變的心臟疾患。有研究表明磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/protein Kinase B，PI3K-AKT）信號通路對心肌細胞的存活及功能有重要調(diào)控效應(yīng)，通過調(diào)控血管平滑肌細胞的增殖、遷移、凋亡等途徑影響CHD的進程，其中凋亡是最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CHD屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”的范疇，認為氣滯、寒凝、痰瘀、虛損是重要病因，其中心血瘀阻是重要證型，故活血化瘀，祛瘀止痛是重要治則[1-3]。血府逐瘀湯具有活血化瘀、行氣止痛的作用，臨床不乏其有效治療CHD的報道[4-7]，但其作用機制目前尚無統(tǒng)一定論，基于此我們利用CHD大鼠模型，深入研究血府逐瘀湯的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30只雄性SD大鼠，購買自濟南金豐實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（魯）2014 0006），所有動物均飼養(yǎng)于本院動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置如下：溫度（23±1.5）℃，濕度（51±1.5）%，12 h/12 h光暗周期。

1.1.2 藥物 血府逐瘀湯由本院中藥研究院提供，中藥組成：川芎15 g、生地黃12 g、桔梗6 g、柴胡9 g、當(dāng)歸9 g、赤芍9 g、川牛膝12 g、桃仁9 g、紅花9 g、甘草6 g。

1.1.3 試劑與儀器 PI3K一抗抗體（Abcam有限公司，貨號ab32089）、AKT（Abcam有限公司，貨號：ab8805）、Bax（Abcam有限公司，貨號：ab32503）、Bcl-2（Abcam有限公司，貨號：ab32124）、β-actin一抗抗體（Abcam有限公司，貨號ab8226）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天公司），ECL顯影試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 分組 采用數(shù)字隨機法將30只SD大鼠分為空白組、模型組及干預(yù)組，每組10只。3組大鼠在體質(zhì)量、鼠齡各方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2.1.2 模型制備 空白組大鼠接受普通飼料飼養(yǎng)，模型組及干預(yù)組大鼠接受高脂飼養(yǎng)喂養(yǎng)，高脂飼料配制如下：膽固醇∶豬油∶丙硫氧嘧啶∶基礎(chǔ)飼料=4∶10∶0.2∶86的比例配置，模型組和干預(yù)組在接受高脂飼料喂養(yǎng)的同時灌胃10 mL/（kg·d）脂肪乳劑（脂肪乳劑配制方法：豬油20 g溶化后，加膽固醇10 g，膽酸鈉2 g，甲基丙硫氧嘧啶1 g，攪勻，加入20 mL吐溫-80，蒸餾加至100 mL充分混勻，即成，用時以37 ℃水浴融化），連續(xù)喂養(yǎng)7周[8]。

1.2.2 干預(yù)方法 造模后干預(yù)組大鼠接受血府逐瘀湯灌胃，按大鼠與人體間等效劑量換算成1.32 g/mL，每日灌胃1次，空白組及模型組大鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃，3組均連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 心功能及冠狀動脈血流量 干預(yù)結(jié)束后對3組大鼠經(jīng)房室插入球囊，連接壓力換能器，將所得數(shù)據(jù)傳輸至計算機，計算出左心室收縮壓（LVSP）、左室內(nèi)壓最大變化速率（±dp/dtmax），同時對冠狀動脈血流量進行測定。

1.2.3.2 冠狀動脈及左心室組織HE染色 從各組中隨機選取3只大鼠，取出冠狀動脈及左心室組織，將所獲組織置于10%多聚甲醛固定24 h，隨后取出組織進行脫水，步驟如下：二甲苯（Ⅰ）15 min-二甲苯（Ⅱ）15 min-無水乙醇12 min-無水乙醇5 min-80%乙醇8 min-蒸餾水5 min，隨后將組織進行石蠟包埋，切片后中性樹膠封固，蘇木精液染色5 min，清水沖洗3 min，顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

1.2.3.3 Western blotting法測定PI3K、AKT、Bcl-2、Bax的表達差異 從各組中隨機選取3只大鼠，取出左心室組織稱重后以1∶100比例加入適量蛋白裂解液，靜置10 min后將組織置于離心機15 000 r/min離心10 min，取出上清液后用BCA試劑盒測定各樣本蛋白含量，根據(jù)計算的上樣量將各樣本加入至電泳凝膠，電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，隨后將PVDF膜清洗干凈后加入事先配制好的脫脂蛋白，封閉2 h后使用TBST洗滌，共3次，5 min/次，隨后加入稀釋后的一抗（抗體：稀釋液=1∶1 000），孵育24 h后取出生物膜，再用TBST洗滌，共3次，5 min/次，加入二抗孵育1 h后隨后加入顯影液，在凝膠成像系統(tǒng)中進行化學(xué)發(fā)光顯影、采集及觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢測，符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組心功能及冠狀動脈血流量比較 與空白組比較，模型組和干預(yù)組的LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax、CF絕對值明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中干預(yù)組上述指標(biāo)較模型組高，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 3組HE染色結(jié)果比較 與空白組比較，模型組及干預(yù)組大鼠冠狀動脈內(nèi)中膜均出現(xiàn)明顯增厚，經(jīng)過血府逐瘀湯干預(yù)后干預(yù)組大鼠動脈內(nèi)中膜厚度比值明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖1。左心室組織HE染色：空白組大鼠心肌細胞排列齊整，細胞膜完整，心肌細胞飽滿，胞質(zhì)著色均勻，心肌間質(zhì)無水腫等病理征象。模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，部分出現(xiàn)纖維化，心肌間質(zhì)伴隨明顯的水腫及炎性細胞浸潤，并出現(xiàn)多發(fā)的灶狀的空泡變性。干預(yù)組大鼠部分心肌組織也存在纖維化現(xiàn)象，但程度較模型組減輕，心肌間質(zhì)有少量炎性細胞浸潤，輕度水腫，少量灶狀的空泡變性。見圖2。

2.3 3組Western blotting法檢測結(jié)果比較 與空白組比較，2組接受造模的大鼠心肌組織PI3K、Bcl-2表達降低，Bax升高，血府逐瘀湯提高了PI3K及AKT的磷酸化程度，上調(diào)了Bcl-2表達，抑制了Bax的水平。見圖3。

3 討論

CHD的發(fā)生發(fā)展與高脂血癥有緊密的關(guān)系，脂質(zhì)長時間沉積于血液中，不斷刺激動脈血管內(nèi)膜，導(dǎo)致結(jié)締組織增生而引起冠脈管腔狹窄和冠脈痙攣性改變，導(dǎo)致心肌組織缺血缺氧，從而出現(xiàn)本病。故本研究參照諸多文獻[9-11]后通過飼養(yǎng)高脂飼料、灌胃脂肪乳制備CHD模型。CHD屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”等范疇，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可分為寒凝心脈證、心血瘀阻證、氣滯心胸證、痰濁阻滯證等，其中瘀阻心脈是臨床發(fā)病率最高的證型，多數(shù)CDH患者年事已高，且病程日久，久病體虛，氣血陰陽虧虛，無法濡養(yǎng)，不榮則痛，加之痰濁、寒凝、氣滯心脈，病邪壅堵其中，不通則痛，虛以氣虛為基礎(chǔ)，實則以瘀血為常見。氣為血帥，氣行則血行，氣虛無法順利推動血行，血運遲緩而留滯為瘀，而瘀滯于心脈，導(dǎo)致氣血運行失衡誘發(fā)本病。血府逐瘀湯源自王清任《醫(yī)林改錯》，川芎、赤芍、生地黃、當(dāng)歸、桃仁、紅花、牛膝、枳殼、桔梗、柴胡及甘草是本方主要藥物，被視為活血化瘀法的經(jīng)典方劑。方中桃仁破血化瘀散滯，亦可潤燥，紅花有活血化瘀以止痛，二藥共為君藥。桃仁性味苦平，主要入心經(jīng)、肝經(jīng)以及大腸經(jīng)，在祛瘀生新的基礎(chǔ)上有潤腸通便之功，現(xiàn)代藥理研究顯示桃仁提取物有擴張血管降低血行阻力的作用，并可降低血液黏稠度;紅花性溫味辛，主要入心經(jīng)及肝經(jīng)，臨床大量研究證實紅花主要成分紅花黃色素可明顯改善CHD發(fā)作時引發(fā)的心絞痛癥狀，藥理研究[12-13]發(fā)現(xiàn)其具有抗血栓形成、降低心肌細胞興奮性、抗凝、擴張血管等作用，故可明顯改善心脈瘀滯，促進血運。川芎可加強君藥的活血化瘀之功，氣為血帥，氣行則血行，血行則諸瘀自除。其主要成分川芎嗪可催化血管內(nèi)皮細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性，對維持血管穩(wěn)態(tài)有明顯作用，抑制CHD機體血管內(nèi)皮炎性效應(yīng)。赤芍性寒味苦，可活血化瘀、涼血消腫止痛，可緩解不通而痛的病癥，與川芎合用共奏活血化瘀祛瘀之功。牛膝可引血下行，經(jīng)通則痛止，將郁結(jié)于胸中的瘀血引行于下，條暢上焦氣機。川芎、赤芍、牛膝三藥合用共為臣藥。柴胡有疏肝解郁，暢達清陽之功，可通過調(diào)暢氣機治療氣滯導(dǎo)致的胸悶、胸痛之癥。桔梗與枳殼同用，一升一降，氣順則郁解[14-15]。當(dāng)歸有補血活血的作用，可雙向調(diào)節(jié)心肌平滑肌，其藥理成分是生物活堿。此外當(dāng)歸主要成分阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，抑制血小板血栓素a2（txa2）的生成，增強鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用，是生產(chǎn)用于治療心血管疾病藥品的基本原料[16-17]。生地黃有清熱涼血之功，亦可養(yǎng)陰生津，有祛瘀不傷血之功，甘草以緩解諸藥藥性，亦可緩解止痛。諸藥合用即可條暢全身氣機，又可消除局部血瘀[15-16]。本研究結(jié)果顯示與空白組比較，模型組LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax、CF絕對值明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中干預(yù)組上述指標(biāo)較模型組上調(diào)，這說明血府逐瘀湯有改善CDH模型大鼠的心功能和血供。同時我們證實血府逐瘀湯可明顯改善心肌組織的病理形態(tài)，通過抑制大鼠動脈內(nèi)中膜厚度增強冠脈血液灌流量。

細胞凋亡是程序性細胞死亡，諸多促細胞凋亡及抑制細胞凋亡的蛋白參與其中。PI3K-Akt信號通路是目前備受關(guān)注的與凋亡關(guān)系密切的信號通路[18-19]，其中Akt磷酸化后可進一步誘導(dǎo)Bad磷酸化，當(dāng)Bad磷酸化后結(jié)合細胞質(zhì)抗凋亡蛋白14-3-3，將Bcl/Bad復(fù)合物中的Bcl-2解除出來，從而引發(fā)抗凋亡作用。此外Akt可直接磷酸化叉頭轉(zhuǎn)錄因子而抑制細胞凋亡。細胞色素C從線粒體膜間隙的釋放，在細胞的凋亡早期階段，被磷酸化的Akt可抑制細胞色素C轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)內(nèi)，阻斷細胞異常凋亡程序進行[20-21]。與空白組比較，2組接受造模的大鼠心肌組織PI3K、Bcl-2表達降低，Bax升高，血府逐瘀湯可上調(diào)PI3K及AKT的磷酸化程度，上調(diào)了Bcl-2表達，抑制了Bax的水平，由此證明血府逐瘀湯可通過介導(dǎo)PI3K-Akt信號通路而發(fā)揮作用。

綜上所述，血府逐瘀湯有抑制CHD模型大鼠血管重塑及保護心臟的效應(yīng)，其作用機制可能與介導(dǎo)PI3K-AKT信號通路有關(guān)。

參考文獻

[1]楊可鑫，于莉，張會永，等.冠心病心絞痛血瘀證證候組成的相關(guān)文獻研究分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，2（11）：1-4.

[2]劉磊.中醫(yī)綜合療法對經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后冠心病患者心功能及心肌缺血再灌注的影響[J].河南中醫(yī)，2018，3（10）：1511-1514.

[3]顧婷婷，孫怡春.動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的中醫(yī)體質(zhì)分布研究進展[J].河北中醫(yī)，2018，40（9）：1427-1431.

[4]黃文華，徐英妹，蔣凌飛，等.血府逐瘀湯加減聯(lián)合西藥治療冠心病心絞痛36例臨床觀察[J].湖南中醫(yī)雜志，2018，34（9）：7-9.

[5]程建生.血府逐瘀湯聯(lián)合阿司匹林對冠心病心絞痛患者的療效觀察[J/OL].河南醫(yī)學(xué)研究，2018，27（16）：1.

[6]吳志軍.血府逐瘀湯治療冠心病心絞痛42例臨床觀察[J].湖南中醫(yī)雜志，2018，34（8）：48-50.

[7]丁萌.加減血府逐瘀湯聯(lián)合曲美他嗪治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛效果評價[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管?。ㄟB續(xù)型電子期刊），2018，6（23）：182-183.

[8]黃漠然.營心丹對冠心病動物模型的作用及作用機理研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2018.

[9]鄭麗莉.芎歸六君子湯對實驗性大鼠冠心病的治療作用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（1）：23-27+55.

[10]李雅，郭志華，郭慧芳，等.心痛泰對冠心病大鼠腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)及血管重塑的調(diào)控作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（9）：943-946.

[11]張世田，龐路路，馮悅，等.大鼠冠心病心肌梗死模型制備的新方法[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2017，39（3）：179-182.

[12]趙明明，王海蓉，熊峰，等.穩(wěn)心顆粒聯(lián)合美托洛爾治療心房顫動有效性和安全性的Meta分析[J].中國醫(yī)藥，2014，9（4）：458- 463.

[13]賈娟.真武湯合血府逐瘀湯在冠心病心力衰竭治療中的應(yīng)用效果觀察[J].淮海醫(yī)藥，2018，36（5）：591-593.

[14]顧玉彪，馮輝，鄭林，等.加味血府逐瘀湯聯(lián)合利伐沙班對全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后深靜脈血栓發(fā)生的影響[J].中醫(yī)雜志，2018，59（18）：1578-1582.

[15]董得剛.血府逐瘀湯在急性冠脈綜合征的應(yīng)用[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管?。ㄟB續(xù)型電子期刊），2018，6（25）：13-14.

[16]安娜.血府逐瘀湯治療穩(wěn)定型心絞痛的臨床療效評價及安全性分析[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2018，16（15）：104-106.

[17]童繼威，宋麗，唐宋琪，等.血府逐瘀湯組方思路及應(yīng)用淺析[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（62）：223-224.

[18]Liu Z，Wang F，Zhou Z W，et al.Alisertib induces G2/Marrest，apoptosis，and autophagy via PI3K/Akt/mTOR-andp38 MAPK-mediated pathways in human glioblastomacells[J].Am J Translat Res，2017，9（3）：845-873.

[19]Chen Q，Xu T，Li D，et al.JNK/PI3K/Akt signaling pathway is involved in myocardial ischemia/reperfusion injury in diabetic rats：effects of salvianolic acid A intervention[J].Am J Translat Res，2016，8（6）：2534-2548.

[20]Chang H，Wang Q，Shi T，et al.Effect of DanQi Pill on PPARα，lipid disorders and arachidonic acid pathway in rat model of coronary heart disease[J].BMC Complement Altern Med，2016，16：103.

[21]胡文君，張振，戴敏.丹皮酚通過抑制PI3K/AKT-NF-κB通路對LPS誘導(dǎo)的與平滑肌細胞共培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮細胞的保護作用[J].中國中藥雜志，2016，41（12）：2298-2302.

（2018-10-30收稿 責(zé)任編輯：王楊）