高效液相色譜法測定知柏地黃丸中馬錢苷及菝葜皂苷元的含量

劉海蘭 駱桂法 張巍云

摘要 目的：通過高效液相色譜法測定知柏地黃丸中有效成分馬錢苷及菝葜皂苷元的含量。方法：選取高效液相色譜法對知柏地黃丸中成分的含量進(jìn)行測定。色譜條件采用C18色譜柱（型號為Eclipse XDB），該色譜柱的長度為250 mm，色譜柱內(nèi)經(jīng)為4.6 mm，色譜柱填料顆粒直徑為5 μm。進(jìn)樣量為20 μL，流動相采用乙腈（A相）和0.1%磷酸水溶液（B相）的二元體系進(jìn)行梯度洗脫。高效液相色譜法（HPLC）嚴(yán)謹(jǐn)性考察，包括線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收試驗考察，結(jié)果：陰性對照品溶液1在與馬錢苷對照品溶液和供試品溶液色譜圖相同時間處未見相同色譜峰;陰性對照品2在與菝葜皂苷元對照品溶液和供試品溶液色譜圖相同時間處未見相同色譜峰。線性考察結(jié)果顯示回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍分別是：馬錢苷在0.040 54～4.054 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=611.16X+5 664.1（r=0.999 7）;菝葜皂苷元進(jìn)樣量在0.440 01～4.353 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=1.639 7X+11.549（r=0.999 8）。精密度試驗：RSD=0.79%;穩(wěn)定性試驗：色譜峰相對峰面積RSD平均值1.716%;重復(fù)性試驗：色譜峰相對峰面積RSD平均值2.011%。馬錢苷對照品溶液、菝葜皂苷元對照品溶液平均回收率分別為105.719%、98.865%，RSD分別為1.29%、1.36%。201805026、201806013、201807085等3個不同批次號的知柏地黃丸中，馬錢苷成分和菝葜皂苷元成分的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：高效液相色譜法的操作簡單，結(jié)果具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可作為知柏地黃丸質(zhì)量控制的有效方法，而不同批次知柏地黃丸中有效成分含量未見明顯差異。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法;知柏地黃丸;馬錢苷;菝葜皂苷元;精密度;穩(wěn)定性;重復(fù)性;專屬性

Abstract Objective：To determine the content of loganin and sarsasapogenin in Zhibai Dihuang Pills by HPLC.Methods：The chromatographic conditions were determined by C18 column（type Eclipse XDB）.The length of the column was 250 mm，the diameter of the packing particles in the column was 5 micron，and the inner diameter of the column was 4.6 mm.A binary system of acetonitrile（A phase）and 0.1% phosphoric acid aqueous solution（B phase）was used for gradient elution.The method of high performance liquid chromatography（HPLC）was rigorous，including linear relationship，precision，repeatability，stability and sample recovery test.Based on the rigorous premise of HPLC，the content of Zhibai Dihuang Pills was determined.Results：1）Negative reference solution 1 did not show the same chromatographic peak at the same time as loganin reference solution and test solution，while negative reference solution 2 did not show the same chromatographic peak at the same time as sarsasapogenin reference solution and test solution.The results showed that loganin and sarsapogenin had good specificity. 2）Linear regression equation，correlation coefficient and linear range were：loganin had good linear relationship with peak area in the range of 0.040 54～4.054 μg，and the regression equation was Y=611.16X+5 664.1（r=0.999 7）; sarsapogenin injection was 0.44 ugh，and the regression equation Y=1.639 7X+11.549（r=0.999 8）was obtained. 3）The precision test showed that the RSD was 0.79%.The stability test showed that the RSD average value of the relative peak area was 1.716%.It indicated that the stability of Zhibai Dihuang Pills was good within 24 hours.The value was 2.011%，indicating that the solution of Zhibai Dihuang Pills had good reproducibility. 4）The results showed that the average recoveries of loganin and sarsapogenin were 105.719% and 98.865% and RSD were 1.29% and 1.36% respectively，suggesting that the high-phase liquid phase detection method was reliable. 5）The contents of strychnine and sarsapogenin in Zhibai Dihuang Pills of different batches，such as 201805026，201806013 and 201807085，were not significantly different.Conclusion：The HPLC method is simple，accurate，stable and reproducible.It can be used as an effective method for quality control of Zhibai Dihuang Pills.There was no significant difference in the content of active ingredients in different batches of Zhibai Dihuang Pills.

Key Words High performance liquid chromatography; Zhibai Dihuang Pills; Loganin; Sarsapogenin; Precision; Stability; Repeatability; Specificity

中圖分類號：R289.4;R2847文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.014

知柏地黃丸是由中藥知母、黃柏、熟地黃、山藥、山茱萸（制）、牡丹皮、茯苓、澤瀉，以蜂蜜為輔料制作而成的中成藥，知柏地黃丸出自《醫(yī)宗金鑒》，是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上加了知母和黃柏兩味藥，全方共奏滋肝脾腎陰，清相火泄?jié)駶嶂1]。根據(jù)《藥性論》所述山茱萸曰：“止月水不定，補腎氣，興陽道，添精髓，療耳鳴，止老人尿不節(jié)”。即山茱萸具有補益肝腎，澀精固脫的功效，臨床主要用于遺尿[1]、崩漏[1-2]、陽痿[1，3-4]等病證;山茱萸的主要成分含有馬錢苷，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，馬錢苷能有效增強小鼠的抗疲勞能力和提高小鼠的記憶力等[5-6]。根據(jù)《用藥法象》所描述知母曰：“瀉無根之腎火，療有汗之骨蒸，止虛勞之熱，滋化源之陰”。即知母具有清熱瀉火、生津潤燥之功，用于骨蒸潮熱和內(nèi)熱消渴療效奇佳，現(xiàn)代藥理學(xué)顯示，知母的主要成分之一為菝葜皂苷元[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，菝葜皂苷元能有效改善骨質(zhì)疏松，同時能夠上調(diào)超氧化物氣化酶的表達(dá)水平，增強大鼠的抗氧化能力[9-10]。盡管知柏地黃丸在臨床上已經(jīng)使用多年，且療效良好，但是對其藥物的有效成分進(jìn)行定量分析的研究仍較少，未能有效建立一種中藥質(zhì)量評定方法，不利于本品的產(chǎn)品質(zhì)量控制。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是目前在中藥成分研究領(lǐng)域中最為廣泛使用的分析方法之一，其具有應(yīng)用范圍廣、檢測分析快、藥物分離、檢出靈敏度高、操作自動簡便等優(yōu)點[11-12]，本研究使用HPLC對知柏地黃丸中馬錢苷和菝葜皂苷元這2個成分含量進(jìn)行測定?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent高效液相（型號：1200型），其中該色譜系統(tǒng)還包括以下主要適配零件和系統(tǒng)，如二極管陣列DAD檢測器（型號：G1315D型）、四元梯度泵（型號：G1311A型）、柱溫箱（型號：G1316A型）、在線脫氣機和化學(xué)工作站（型號：G1322A型）。購買于上海精密儀器儀表公司的電子分析天平（型號：FA1004N型）和超聲波清洗器（型號：KQ-100DE）;購買于法國MILIPORE公司的超純水系統(tǒng)（型號：Mili-RO Plus型）;上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;雙光束紫外可見分光光度計（型號：MQK-UV1800型）購買于上海米青科實業(yè)有限公司。

1.2 試藥 于中國藥品生物制品檢定所購買馬錢苷對照品和菝葜皂苷元對照品，批號分別為11640-200502、11074-20041。于美國Fisher公司購買色譜純乙腈和甲醇，批號分別為：102489、101437。于上海拓國滬試實驗室器材股份有限公司購買的磷酸分析純（AR級，批號：20170412）。

1.3 分析藥品 知柏地黃丸（由九芝堂股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z11020152），選擇201805026、201806013、201807085等3個不同批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用C18色譜柱（型號為Eclipse XDB），該色譜柱的長度為250 mm，色譜柱內(nèi)經(jīng)為4.6 mm，色譜柱填料顆粒直徑為5 μm，柱溫25 ℃。進(jìn)樣量為20 μL，流動相采用乙腈（A相）和0.1%磷酸水溶液（B相）的二元體系進(jìn)行梯度洗脫，具體的梯度洗脫程序和流速見表1。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取馬錢苷對照品，加80%甲醇制成每毫升含馬錢苷30 μg的溶液，即得馬錢苷對照品溶液。精密稱取菝葜皂苷元對照品適量，加甲醇制成每1.0 mL含0.2 mg的溶液，即得菝葜皂苷元對照品溶液。混合對照品即取適量菝葜皂苷元對照品溶液和馬錢苷對照品溶液混合均勻即得。

2.3 供試品溶液的配制 精密稱定知柏地黃丸1 g，置于具塞錐形瓶中，用量筒精密加入乙醇20 mL，稱定重量并記錄，浸泡過夜。超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）20 min，待冷卻后稱定重量并記錄，用乙醇補足重量差，搖勻，取濾過液待用。精密量取濾過液10 mL，蒸干，加水和鹽酸分別為10 mL、1 mL，采用加熱回流法2 h后關(guān)火，取出冷卻至25 ℃，一邊滴加40%氫氧化鈉溶液一邊均勻振搖充分混合，至溶液顏色由橙黃突變?yōu)槌燃t停止滴加40%氫氧化鈉溶液;在此基礎(chǔ)上用三氯甲烷振搖提取2次，30 mL/次，合并2次三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取過濾液，即得知柏地黃丸供試品溶液。陰性對照品溶液1，知柏地黃丸去山茱萸后同供試品溶液提取方法即得;陰性對照品溶液2，知柏地黃丸去知母后同供試品溶液提取方法即得。

2.4 專屬性試驗 取20 μL馬錢苷對照品溶液、菝葜皂苷元對照品溶液、供試品溶液和各自對應(yīng)的陰性對照品溶液，根據(jù)2.1的色譜條件進(jìn)行專屬性試驗，結(jié)果顯示陰性對照品溶液1在與馬錢苷對照品溶液和供試品溶液色譜圖相同時間處未見相同色譜峰;陰性對照品2在與菝葜皂苷元對照品溶液和供試品溶液色譜圖相同時間處未見相同色譜峰。提示馬錢苷和菝葜皂苷元具有良好的專屬性。見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取馬錢苷對照品10.14 mg，放置25 mL量瓶中，加入80%甲醇溶解并稀釋至刻度定容，即得含馬錢苷0.405 3 mg/mL的馬錢苷對照品溶液，分別精密吸取2、3、5、10、20 μL，按照“2.1”項下色譜方法進(jìn)樣。以峰面積積分值（Y）的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的自然對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，馬錢苷在0.040 54～4.054 μg范圍內(nèi)與峰面積良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=611.16X+566 4.1（r=0.999 7）。精密量取濃度為0.217 3 mg/mL的菝葜皂苷元對照品溶液適量，同馬錢苷線性回歸方法，得回歸方程Y=1.639 7X+11.549（r=0.999 8）。結(jié)果表明，菝葜皂苷元進(jìn)樣量在0.440 01～4.353 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。見表2。

2.6 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，在一組相同的測量程序、相同測試地點和相同的色譜條件等情況下，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣20 μL/次。結(jié)果顯示，RSD=0.79%，表明高效液相儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 由于固定相的有限穩(wěn)定性，為確保每一次研究之間的結(jié)果誤差最小，進(jìn)行指紋圖譜對比研究之前，取同一批號供試品溶液以確定供試品溶液的穩(wěn)定性，分別室溫放置0、4、8、12、24 h后進(jìn)行HPLC檢測，各色譜峰相對峰面積的RSD<3%則說明穩(wěn)定性良好，本研究穩(wěn)定性結(jié)果顯示色譜峰相對峰面積RSD平均值1.716%，提示知柏地黃丸供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 為確保研究的客觀性，進(jìn)行指紋圖譜對比研究之前，需要進(jìn)行短時間內(nèi)的HPLC連續(xù)重復(fù)性測試，精密量取6份同一批號供試品溶液，進(jìn)樣量20 μL，連續(xù)進(jìn)樣，各色譜峰相對峰面積的RSD<3%表示重復(fù)性良好，本研究結(jié)果顯示色譜峰相對峰面積RSD平均值2.011%，提示知柏地黃丸供試品溶液的重復(fù)性良好。見表3。

2.9 回收率試驗 精密吸取已知含量的知柏地黃丸供試品溶液6份，均為1 mL/份，分別置于10 mL容量瓶中，每一份均精密加入等量已知濃度的0.405 3 mg/mL馬錢苷對照品溶液、0.217 3 mg/mL菝葜皂苷元對照品溶液，加入超純水稀釋至刻度定容混合均勻后，進(jìn)行加樣回收試驗的檢測，根據(jù)2.1的色譜條件進(jìn)行檢測并計算加樣回收率。結(jié)果顯示馬錢苷對照品溶液、菝葜皂苷元對照品溶液平均回收率分別為105.719%、98.865%，RSD分別為1.29%、1.36%，提示高相液相檢測方法所測加樣回收率結(jié)果可靠。見表4。

2.10 樣品檢測結(jié)果

取201805026、201806013、201807085等3個不同批次號的知柏地黃丸，根據(jù)2.2供試品溶液配制，每批樣品都根據(jù)2.1的色譜條件進(jìn)行重復(fù)測試3次，知柏地黃丸中成分的含量取3次測定的平均值，結(jié)果顯示，3個不同批次的知柏地黃丸中馬錢苷成分和菝葜皂苷元成分的含量未見明顯差異。見表5。

3 討論

知柏地黃丸出自于清代吳謙·《醫(yī)宗金鑒》，另據(jù)李明權(quán)考證，知柏地黃丸最早是以“滋陰八味丸”的名稱出現(xiàn)于明代張介賓所著的《景岳全書·新方八陣》。知柏地黃丸為《中華人民共和國藥典》2015年版1部收載品種，是滋陰清熱的經(jīng)典名方，應(yīng)用廣泛，對陰虛火旺型糖尿病、老年干燥癥、女性更年期綜合征、腎病綜合征等均具有良好的治療效果。近年來經(jīng)中醫(yī)辨證后靈活使用，對慢性咽炎、急性尿路感染等疾病也有較好療效。利用現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法建立陰虛模型對其細(xì)胞水平和分子水平的藥理作用機制研究也證明了其治療陰虛的作用。知柏地黃丸中的君藥為知母，而知母有效成分為多種甾體皂苷，其皂苷主要為菝葜皂苷元。知母根莖中含甾體皂苷約為6%[14]，有知母皂苷A1、A2、A3、A4、B1、B2等。菝葜皂苷元為知母中幾種主要甾體皂苷的母核皂苷元，因此，可通過測定菝葜皂苷元的含量對知母藥材的質(zhì)量進(jìn)行控制，進(jìn)而有效、準(zhǔn)確地控制知柏地黃丸的質(zhì)量。

山茱萸是知柏地黃丸中關(guān)鍵的臣藥之一，目前有關(guān)山茱萸含量測定方法的研究頗多，主要是以熊果酸、齊墩果酸和馬錢苷等為含量檢測指標(biāo)。山茱萸中熊果酸含量測定的文獻(xiàn)報道雖比較多，但熊果酸并非山茱萸的特有成分，它存在于山楂、馬鞭草、車前草、紫珠、女貞子、懷牛膝等許多藥材中，并且熊果酸與齊墩果酸均屬三萜酸，這2種成分在天然植物中又是共生共存的，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是差向異構(gòu)體，兩者的極性也幾乎無差別[15]。有實驗表明，在薄層板上應(yīng)用《中華人民共和國藥典》條件無法分離開，實驗中所測得實際熊果酸含量其實是熊果酸與齊墩果酸含量的總和[16-17]。馬錢苷為山茱萸主要有效成分，測定其含量，可為山茱萸及其制劑提供質(zhì)量控制的有效手段。在提取方法的選擇上，以馬錢苷和菝葜皂苷元含量作為考察指標(biāo)，對提取溶劑進(jìn)行考察：取樣品1 g 3份，分別精密加入甲醇，80%甲醇，50%甲醇25 mL，超聲30 min。用80%甲醇提取的含量較高，所以選用80%甲醇作為提取溶劑。對提取方式及時間進(jìn)行考察：取樣品1 g 6份，精密加入80%甲醇25 mL，取其中3份回流，提取時間分別為20，30，40 min;取另外3份超聲，提取時間分別為20，30，40 min。回流和超聲2種提取方式對含量結(jié)果影響不大，因超聲操作較為簡便，且20 min能將馬錢苷和菝葜皂苷元提取完全，故選擇超聲處理（功率250 W，頻率49 kHz）20 min。

綜上所述，采用高效液相色譜法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，加樣回收率高，可用于知柏地黃丸的質(zhì)量控制。在對具有多種有效成分，且相互間可發(fā)生直接影響的知柏地黃丸來說，檢測藥物有效成分是，單一的對一種成分或少數(shù)幾個有效成分進(jìn)行檢測，仍不足以較為全面地體現(xiàn)出知柏地黃丸的質(zhì)量控制效果，故而未來將進(jìn)一步結(jié)合檢測多種有效成分，更全面反映知柏地黃丸的質(zhì)量評價，以期為知柏地黃丸的質(zhì)量控制及藥理研究工作提供相關(guān)思路。

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（2018-10-29收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）