利用基因組編輯技術(shù)定點(diǎn)突變IPA1基因創(chuàng)制水稻新株型材料

劉華清 孫慶山 楊紹華 周淑芬 王鋒

摘?要：【目的】水稻株型改良是提高水稻產(chǎn)量的一個有效途徑。水稻理想株型基因IPA1是一個調(diào)控水稻株型的關(guān)鍵基因，利用基因組編輯技術(shù)（TALENs技術(shù)）定點(diǎn)突變水稻IPA1基因，了解IPA1基因不同序列變異的株型效應(yīng)，為進(jìn)一步利用IPA1基因創(chuàng)制實(shí)用型水稻新株型材料奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肨ALENs技術(shù)定點(diǎn)突變優(yōu)良恢復(fù)系明恢86的IPA1基因，通過測序鑒定突變體，種植于標(biāo)準(zhǔn)小區(qū)，調(diào)查分析其株型相關(guān)性狀。【結(jié)果】利用TALENs技術(shù)獲得了8種不同序列突變的水稻ipa1突變體，并通過轉(zhuǎn)基因植株自交結(jié)合PCR分析篩選到去除了TALENs表達(dá)框，獲得4種不含外源轉(zhuǎn)基因成分的純合突變體材料（IPA1基因表達(dá)區(qū)分別缺失2、4、16、23 bp）。表型分析發(fā)現(xiàn)，IPA1基因突變能夠顯著改變水稻的株高、有效穗數(shù)、穗長及穗粒數(shù)等性狀。與野生型比較，缺失移碼突變體株高降低7.9%～11.4%，有效穗數(shù)增加46.9%～68.4%，穗長短24.2%～29.3%，穗粒數(shù)減少31%～34%，結(jié)實(shí)率和千粒重差異不明顯?！窘Y(jié)論】利用TALENs技術(shù)定點(diǎn)突變水稻IPA1基因能夠明顯改變水稻株高、有效穗數(shù)、穗長及穗粒數(shù)等主要性狀，產(chǎn)生水稻新株型。

關(guān)鍵詞：水稻;IPA1基因;基因組編輯;突變體;新株型

中圖分類號：S 511;S 330;Q 812文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）08-867-06

Abstract： 【Objective】 The site-directed mutagenesis on grain-yield-related IPA1 to modifying the morphological characteristics of a rice plant for breeding purpose was studied.?【Method】 Minghui 86， a rice elite restorer， was used in the study.?The primary gene that governs the gain yield of the rice plant， IPA1， was edited using the transcription activator-like effector nucleases （TALENs） to generate mutated plants for subsequent identification by gene sequencing and cultivation on standard plots to verify results of the mutagenesis.?Eight transgenic rice plants that differed in ipa1 sequences had the TALENs boxes cleaved for self-crossing followed by screening with PCR analysis to arrive at 4 mutants with 2bp， 4bp， 16bp or 23bp segment deleted in their IPA1 genes. 【Result】A phenotypic analysis on the 4 mutants free of exogenous transgenic elements confirmed that the site-directed mutagenesis on IPA1 had significantly altered the plant height， effective panicle number， panicle length， and grain number per panicle of the mutated rice plants.?Compared with the wild-type Minghui 86， the plant height of the mutants was decreased by 7.9% to 11.4%， the effective panicle number increased by 46.9% to 68.4%， the panicle length shortened by 24.2% to 29.3%， the number of grains per panicle reduced by 31% to 34%， but the seed setting rate and 1000-grain weight were not changed significantly.?【Conclusion】 The site-directed mutagenesis applying TALENs on IPA1 could significantly modify the plant height， effective panicle number， panicle length， and grain number per panicle on the new rice plant.?The technique could be applied for the breeding program on rice to increase grain yield.

Key words：rice （Oryza sativa L.）; IPA1 gene; genomic editing; mutant; new plant architecture

0?引言

【研究意義】提高水稻產(chǎn)量一直是水稻育種研究的重要內(nèi)容。前人研究表明，理想株型與雜種優(yōu)勢利用相結(jié)合是提高水稻產(chǎn)量的有效途徑[1-2]。改良水稻株型實(shí)質(zhì)是協(xié)調(diào)水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀——有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重等主要性狀之間的關(guān)系。傳統(tǒng)雜交育種方法改良水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀存在的不確定性和盲目性，大大限制了水稻高產(chǎn)育種水平的提高。大量水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀基因的克隆及相關(guān)生物技術(shù)的應(yīng)用，特別是近幾年發(fā)展起來的基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用，為定向改良水稻株型和產(chǎn)量相關(guān)性狀創(chuàng)造了條件，也提供了一條有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】基因組編輯技術(shù)（genome editing）是一種在基因組水平上對DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。其基本原理是利用序列特異性核酸酶（sequence-specific nucleases，SSNs）錨定基因組特定的位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，激活細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制，進(jìn)行非同源末端連接或同源重組修復(fù)。在修復(fù)過程中會發(fā)生基因序列改變，從而實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)缺失、定點(diǎn)插入或替換等突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的[3]。目前用于基因組編輯的序列特異性核酸酶（SSNs）主要有3類：鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease， ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease， TALEN）和CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9）系統(tǒng)。近年來，隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展和完善，基因組編輯技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于作物遺傳及育種種質(zhì)創(chuàng)新研究[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】水稻理想株型基因Ideal Plant Architecture 1（IPA1）是決定株型的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，編碼SPL14蛋白，是一個SPL轉(zhuǎn)錄因子家族成員， 其表達(dá)主要受miRNA156調(diào)節(jié)[5-6]。當(dāng)miRNA156在基因IPA1上的識別位點(diǎn)發(fā)生突變時，干擾miRNA156調(diào)控IPA1 mRNA的降解，使IPA1表達(dá)量增高，導(dǎo)致水稻植株的分蘗數(shù)減少，株高和穗粒數(shù)增加，形成所謂的分蘗少、穗大、株型好的 “理想株型”[5-7]。但由于不同的生態(tài)環(huán)境及育種目標(biāo)，對株型的要求有所差異，使得理想株型的應(yīng)用受到很大限制。通常，水稻多穗型品種較少蘗、大穗型品種有更好的適應(yīng)性。本研究從創(chuàng)制與理想株型相反的水稻株型材料入手，探討創(chuàng)制多穗型水稻株型的方法，并了解其株型特征。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于基因組編輯技術(shù)在基因定向突變方面的有效性，本研究利用TALENs技術(shù)，定點(diǎn)突變明恢86背景下的IPA1基因，創(chuàng)制一批IPA1基因突變體，獲得與理想株型相反的水稻株型材料，為水稻株型改良提供新的遺傳變異材料。

1?材料與方法

1.1?材料

本研究所用受體水稻品種明恢86，是一個優(yōu)良的秈型三系雜交稻恢復(fù)系[8]。所用菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存; TALEN 左臂骨架載體、TALEN 右臂骨架載體、植物表達(dá)載體p1300M等質(zhì)粒載體均由上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司提供。

1.2?方法

1.2.1?基因序列的獲取及靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)和選擇

利用粳稻日本晴基因組上IPA1基因的序列信息（NCBI：http：//www.ncbi.nlm.gov/），考慮IPA1基因序列較長，設(shè)計(jì)了兩對分段擴(kuò)增引物（IPA1-F1：GCT ACA GTC TCC TTC CCA CC， IPA1-R1：CAG GCA AGT CAC ATC ACT CAA C;IPA1-F2：CAC AGC AGC AGT GGA TAG GAI，PA1-R2：CGC ATT ATT ATT CAT CAC AGG GA），通過PrimeSTAR HS DNA Polymerase PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增獲得明恢86中IPA1基因全長序列，與日本晴進(jìn)行比對分析。

靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)和選擇是利用相關(guān)TALENs靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)輔助網(wǎng)站（或www.talendesign.org/）獲得基因可供選擇的靶位點(diǎn)，綜合基因特點(diǎn)選擇最優(yōu)靶位點(diǎn)[9]。

1.2.2?載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

合適靶位點(diǎn)選取后，明確TALEN左臂、右臂識別序列，根據(jù)上海斯丹賽公司提供的試劑盒使用說明書及模塊組合方法，首先分別合成左、右臂識別元件及其連接的FokI核酸酶的表達(dá)載體。在由上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司提供的TALEN 左臂骨架載體、TALEN 右臂骨架載體的基礎(chǔ)上添加識別靶位的TALE蛋白的表達(dá)元件。驗(yàn)證正確后，再將左、右臂識別元件及其連接的FokI核酸酶的表達(dá)元件連接到植物表達(dá)載體p1300M上，并通過測序確定，構(gòu)建完整的TALENs表達(dá)載體。將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，采用本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻胚性愈傷轉(zhuǎn)化方法[10 ]，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。

1.2.3?水稻遺傳轉(zhuǎn)化苗陽性植株篩選

檢測TALENs表達(dá)載體框是否成功插入到再生水稻基因組中，本研究通過TALENs表達(dá)載體框引物（TF：5-?TGA CCG AGT TCA AGT TCC-3′;TR：5′-TTG CGG GAC TCT AAT CA-3′）PCR分析遺傳轉(zhuǎn)化苗的總DNA，能夠擴(kuò)增出392 bp特異性條帶的為陽性轉(zhuǎn)化植株。

1.2.4?靶位點(diǎn)序列突變檢測

TALENs載體遺傳轉(zhuǎn)化陽性植株的靶位點(diǎn)序列分析采用PCR擴(kuò)增，然后測序分析。擴(kuò)增引物（ITF： GCA GTG GCG GGA TAT GGT;ITR：ATC GTG TTG CTG GTT TGG）基于靶位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)。對于測序后確定的突變體，當(dāng)靶位點(diǎn)序列缺失或插入4 bp以上時，后代追蹤突變位點(diǎn)采用PCR結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠（2%）電泳分析，而不是測序分析，以提高效率，減少費(fèi)用。

1.2.5?突變體的相關(guān)表型分析

IPA1是影響株型的重要基因，突變體的表型分析主要從株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重、穗長等方面考察表型。因穗數(shù)受環(huán)境影響較大，所以在突變體周圍種植保護(hù)行，以盡量減少環(huán)境造成的誤差。所有的田間調(diào)查數(shù)據(jù)都進(jìn)行3次重復(fù)，并用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?目標(biāo)基因序列分析及靶位點(diǎn)選擇

為了準(zhǔn)確利用基因組編輯技術(shù)編輯秈稻恢復(fù)系明恢86的理想株型基因IPA1，需要了解明恢86中IPA1基因序列信息。因此，利用PCR擴(kuò)增明恢86背景下IPA1基因序列，測序后比對發(fā)現(xiàn)，明恢86中IPA1基因序列與日本晴的一致。

依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，基因IPA1是水稻分蘗數(shù)的一個負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)序列區(qū)有一個miRNA156結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)序列發(fā)生堿基替換突變時，基因IPA1的表達(dá)產(chǎn)物增加，引起水稻株型的變化。為了解該miRNA156結(jié)合位點(diǎn)區(qū)發(fā)生強(qiáng)突變對水稻株型的影響，本研究TALENs的靶位點(diǎn)選擇在miRNA156結(jié)合的位點(diǎn)附近（圖1）。依據(jù)TALENs靶序列設(shè)計(jì)原則，本研究設(shè)計(jì)了2個TALENs靶位（表1），分別利用這2個靶序列構(gòu)建了相應(yīng)的TALENs表達(dá)載體TIPA1-1和TIPA1-2，以期增加獲得期望突變的概率。

2.2?農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和陽性再生克隆的篩選

將所構(gòu)建的TALENs載體（TIPA1-1和TIPA1-2）分別經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。PCR檢測發(fā)現(xiàn)，不同的載體轉(zhuǎn)基因后代的陽性克隆率有所不同?？偟目碩ALENs載體的陽性克隆率較高，TIPA1-1和TIPA1-2的陽性克隆率分別為94.7%和85.1%（表2、圖2）。

2.3?轉(zhuǎn)基因植株中靶位點(diǎn)序列檢測

對TALENs載體獲得T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株，用引物ITF/ITR擴(kuò)增IPA1基因的靶位點(diǎn)區(qū)，測序發(fā)現(xiàn)TIPA1-1載體轉(zhuǎn)基因陽性克隆中只有2個克隆的植株靶位點(diǎn)有突變，陽性植株突變率約5.6%;而TIPA1-2載體轉(zhuǎn)基因后代中未檢測到靶位點(diǎn)的突變（表2）。進(jìn)一步將TIPA1-1和TIPA1-2的抗性愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代后分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TIPA1-1新的再生植株中出現(xiàn)新突變（原來無突變克?。┗蛐碌耐蛔冾愋停ㄔ型蛔兛寺。⒊霈F(xiàn)純合突變和大片段缺失的類型;連續(xù)繼代兩代后即出現(xiàn)缺失16 bp的純合突變和缺失180 bp的大片段缺失突變體。在TIPA1-1繼代分化苗中篩選到31株突變體，突變類型有8種（圖3）。而在TIPA1-2繼代分化苗中仍未篩選到靶位點(diǎn)突變植株，推測TIPA1-2的TALENs蛋白可能缺少活性。

2.4?不含轉(zhuǎn)基因成分突變體植株篩選

將上述目標(biāo)基因序列突變的T0代植株進(jìn)行自交，獲得T1代種子，種植成T1代植株。利用載體引物對這些T1代植株中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行PCR分析，篩選出不含轉(zhuǎn)基因成分的T1代植株（圖4）。

再利用測序（單堿基變異）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（多堿基缺失或插入）對不含轉(zhuǎn)基因成分植株中靶位點(diǎn)序列進(jìn)行分析，獲得不含外源轉(zhuǎn)基因成分的純合或雜合靶基因突變體（圖5）。進(jìn)一步對純合突變體的農(nóng)藝性狀進(jìn)行選擇可獲得水稻新種質(zhì)。

2.5?IPA1-TALENs轉(zhuǎn)基因植株后代表型觀察及新株型材料創(chuàng)制

選擇不含外源轉(zhuǎn)基因成分的3種突變體（缺失2、4、16 bp移碼突變體）觀察田間表型。田間調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3種突變體的表型變化一致，株高相對野生型顯著降低，而分蘗數(shù)顯著增多（圖6）。

對考種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，IPA1基因突變能夠顯著改變水稻的株高、有效穗數(shù)、穗長及穗粒數(shù)。在明恢86遺傳背景下，缺失移碼突變體的株高為90.6～94.1 cm、有效穗數(shù)為14.4～16.5個· 株-1、穗長為18.1～19.4 cm、穗粒數(shù)為113.2～122.7粒、結(jié)實(shí)率為79.20%～83.70%、千粒重為28.1～28.8 g。與野生型比較，突變體的株高降低7.9%～11.4%，有效穗數(shù)增加46.9%～68.4%，穗長變短24.2%～29.3%，穗粒數(shù)減少31%～34%，結(jié)實(shí)率和千粒重差異不明顯（表3）。由此可見，利用TALENs基因組編輯技術(shù)定點(diǎn)突變水稻IPA1基因能夠明顯改變水稻株高、有效穗數(shù)、穗長及穗粒數(shù)等性狀，產(chǎn)生與野生型不同的水稻新株型。

3?討?論

20世紀(jì)90年代， Khush等提出水稻“新株型”（理想株型）概念，其特征是少分蘗、植株較矮、穗粒數(shù)較多、莖稈強(qiáng)壯、根系發(fā)達(dá)并抗多種病蟲害等[18-19]，但依此理念早期進(jìn)行的水稻新株型育種實(shí)踐效果并不理想[20-21]。水稻理想株型育種雖然進(jìn)展緩慢，但有關(guān)理想株型相關(guān)基因的分子遺傳學(xué)研究取得一系列重要進(jìn)展，特別是圍繞水稻理想株型關(guān)鍵基因IPA1的功能及調(diào)控機(jī)制研究[5-6，22-24]，為水稻理想株型育種注入了新的活力。本研究通過基因組編輯技術(shù)定向突變了IPA1基因，在優(yōu)良恢復(fù)系明恢86的背景下創(chuàng)制了一批ipa1基因移碼突變體，表型觀察發(fā)現(xiàn)：其植株顯著矮化，分蘗顯著增多，穗粒數(shù)顯著減少，是一些與理想株型特征完全不同的株型變異。

目前生產(chǎn)上應(yīng)用的每一種水稻株型都有缺陷，這是因?yàn)樗井a(chǎn)量構(gòu)成因子（有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重）間存在一定的負(fù)相關(guān)，增加水稻產(chǎn)量實(shí)質(zhì)是它們彼此之間協(xié)調(diào)或折中的結(jié)果。早期的理想株型材料中，IPA1表達(dá)量增加，可顯著增加穗粒數(shù)、但也顯著減少了分蘗數(shù)，使得理想株型的增產(chǎn)效應(yīng)并不明顯[20-21 ]。對超級稻甬優(yōu)12的最新研究發(fā)現(xiàn)，控制IPA1的表達(dá)水平可以適度調(diào)節(jié)理想株型性狀，從而有可能獲得理想產(chǎn)量[22]。當(dāng)然，實(shí)際生產(chǎn)上應(yīng)用的水稻品種產(chǎn)量形成的遺傳機(jī)理要復(fù)雜得多，不僅僅是IPA1基因，也涉及其他相關(guān)基因及其互作效應(yīng)[25-26]。本研究通過基因編輯突變IPA1基因后產(chǎn)生了一系列多穗型株型突變體，但這些突變體的產(chǎn)量效應(yīng)，特別是與不同不育系配組后的雜種表現(xiàn)，以及與其他產(chǎn)量構(gòu)成性狀基因（如穗粒數(shù)基因、粒重基因等）的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：楊小萍）