固定化酵母發(fā)酵制備辣木果酒的工藝研究

黃春秋 林君 麻少瑩 黃衛(wèi)萍 黃友琴 馬騰飛

摘要：【目的】研究固定化酵母發(fā)酵制備辣木果酒的工藝條件，為辣木資源開發(fā)提供新途徑?！痉椒ā恳愿呋钚愿山湍赴茬?71#為固定酵母載體，通過單因素試驗(yàn)探討辣木液初始糖度、發(fā)酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發(fā)酵pH等因素對辣木果酒酒精度形成的影響，再通過正交試驗(yàn)確定辣木果酒的最佳發(fā)酵工藝條件?！窘Y(jié)果】影響辣木果酒發(fā)酵工藝的因素排序?yàn)榘l(fā)酵溫度>初始糖度>發(fā)酵pH>焦亞硫酸鈉用量，發(fā)酵溫度對辣木果酒酒精度有顯著影響（P<0.05）。固定化酵母發(fā)酵制備辣木果酒的最佳工藝：初始糖度25%、發(fā)酵溫度29 ℃、焦亞硫酸鈉用量80 mg/L、發(fā)酵pH 4.5，在此條件下得到的果酒酒精度達(dá)11.6%（v/v）?！窘Y(jié)論】利用固定化酵母發(fā)酵制得的辣木果酒色澤淡黃、清澈穩(wěn)定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，風(fēng)味獨(dú)特，研究工藝參數(shù)經(jīng)濟(jì)可行，可為規(guī)模化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 辣木果酒;固定化酵母;發(fā)酵;工藝優(yōu)化

中圖分類號： S792.99? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ? ? ?文章編號：2095-1191（2019）09-2065-06

Abstract：【Objective】The processing conditions of using immobilized yeastto ferment Moringa oleifera fruit wine was studied to provide new ways for M. oleifera resource development.? 【Method】The effects of initial sugar content， fermentation temperature， sodium pyrosulfite dosage and pH on the M. oleifera fermentation liquid were studied by single factor experiment with high active dry yeast Angel No.171 as the carrier of fixed yeast. The optimum fermentation conditions of M. oleifera fruit wine were determined by orthogonal experiment. 【Result】The factors affecting the fermentation process of M. oleifera fruit wine were as follows as fermentation temperature>initial sugar content>fermentation pH>sodium pyrosulfite dosage. Fermentation temperature had significant effects on M. oleifera fruit wine alcoholicity（P<0.05）. The results of the single factor experiment of immobilized yeast showed that the optimum initial sugar content， fermentation temperature， sodium pyrosulfite dosage and fermentation pH were 25%， 29 ℃， 80 mg/L and 4.5， respectively. Under such conditions， the obtained alcoholicity was 11.6%（v/v）. 【Conclusion】The obtained M. oleifera fruit wine produced by immobilized yeast fermentation has light yellow color， clear and stable color， elegant M. oleifera fragrance， mellow taste， unique flavor. The processing parameters are feasible， and also can provide data basis for large-scale production.

Key words：? Moringa oleifera; immobilized yeast; fermentation; processing optimization

0 引言

【研究意義】辣木（Moringa oleifera）又稱奶牛樹，為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，傳統(tǒng)辣木生長在非洲東部及印度北部（王立等，2016）。辣木具有良好的功能活性，研究表明，辣木葉和辣木籽中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，已廣泛應(yīng)用于食品生物、醫(yī)藥保健和凈水處理等領(lǐng)域（Jahn，1996）;辣木葉粉比優(yōu)良保健食品螺旋藻含有更高的蛋白質(zhì)和總膳食纖維，且脂肪含量偏低，更符合現(xiàn)代人們的營養(yǎng)健康需求（劉昌芬和李國華，2004）;辣木葉中的植物黃酮、蛋白質(zhì)和脂肪酸具有抗氧化活性和調(diào)節(jié)血糖功能，可作為重要的藥用資源（趙歡等，2017）。2012年11月我國原衛(wèi)生部批準(zhǔn)辣木葉作為新資源食品，盡管國外有著悠久的食用歷史（Anwar et al.，2007），但國內(nèi)尚未被大眾所熟識。目前市場上辣木產(chǎn)品較少，僅有辣木粉、辣木茶飲料等少數(shù)品種，未見辣木發(fā)酵酒、辣木醋等產(chǎn)品銷售。因此，開展辣木發(fā)酵酒尤其是辣木果酒的研究，對于豐富辣木多元化產(chǎn)品和促進(jìn)辣木產(chǎn)業(yè)深加工發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，關(guān)于辣木葉貯藏及相關(guān)食品加工方面的研究已有一些報(bào)道。馬春花等（2018）進(jìn)行辣木鮮葉貯藏保鮮試驗(yàn)，結(jié)果表明，辣木鮮葉在貯藏期間蛋白質(zhì)含量變化不明顯，但維生素含量損失較大，貯藏保鮮的最佳溫度為4 ℃，貯藏時(shí)間不超過7 d;陳玉芹等（2017）以辣木葉為原料制作辣木茶，測得辣木茶含有17種氨基酸，總量為434.90 mg/g，其中含有7種必需氨基酸，含量明顯高于傳統(tǒng)綠茶，可作為一種新型茶品進(jìn)行開發(fā);盧仰文等（2018）以脫脂乳粉為原料，輔以辣木粉和干酪粉制備酸凝辣木干酪，其最佳工藝參數(shù)為脫脂乳粉50 ℃復(fù)水，63 ℃下30 min殺菌，降溫至26 ℃，加入檸檬汁稀釋液B至pH 4.6，靜置20 min，過濾排除乳清，加入0.2%辣木粉和1.0%干酪粉搓揉混勻后得到成品;王小敏等（2018）以辣木葉為原料，加入甘草、山楂和決明子，研發(fā)出一種復(fù)合固體飲料，具有通便功效。國內(nèi)有關(guān)辣木果酒的研究報(bào)道較少，僅見于少量公開的發(fā)明專利。王憲波（2015）先把辣木葉洗凈、陰干、粗碎，制成250～300目的超細(xì)粉，將辣木粉與酵母按50∶1～200∶1的比例摻勻，經(jīng)固體糖化發(fā)酵得到辣木基料;焦家良等（2017）用辣木粉、葛根、牛蒡根和玉竹等原料中一種或幾種混合，干燥、粉碎，過篩制得辣木粉，再經(jīng)水溫30 ℃浸泡，固液分離，然后加入酵母發(fā)酵制得辣木果酒;楊濤（2017）、祝澤英等（2017）將辣木梗、辣木根和高粱混合，經(jīng)酒曲發(fā)酵，過濾即得新型白酒保健辣木果酒?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】發(fā)布的辣木酒專利中，多采用浸泡法制辣木露酒，或與酒曲發(fā)酵制白酒型辣木果酒，尚未見利用固定化酵母發(fā)酵辣木制酒的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】提取辣木葉基料有效成分，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探討辣木液初始糖度、發(fā)酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和pH等因素對辣木果酒殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊?，以期獲得最佳發(fā)酵工藝，為辣木資源的開發(fā)提供新途徑。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

新鮮辣木葉為印度改良種PKM1辣木，采自廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院中草藥園。主要試劑：白砂糖（純度95%，南寧糖業(yè)股份有限公司）;高活性干酵母安琪171#（湖北安琪酵母股份有限公司）;海藻酸鈉（食品級，25 kg/包，安徽中旭生物科技有限公司）;無水氯化鈣（食品級，四川華源盛泰生物科技有限公司）;焦亞硫酸鈉（食品級，25 kg/包，壽光市鼎昊經(jīng)貿(mào)有限公司）;檸檬酸（食品級，山東檸檬生化有限公司）。主要儀器設(shè)備：C21-SK2105電磁爐（廣東佛山美的空調(diào)設(shè)備有限公司）;30B-X型中草藥專用粉碎機(jī)（常州市力度干燥設(shè)備有限公司）;pHSJ-3F型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;WTY型手持旋光儀（泉州中友光學(xué)儀器有限公司）;DHG-9245A恒溫箱干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省常州市金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;AR153CN型分析天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司];實(shí)驗(yàn)室型立式殺菌鍋DN400型（上?？苿跈C(jī)械設(shè)備有限公司）;酒精計(jì)（河北省武強(qiáng)縣儀都玻璃儀器儀表廠）;NAI-ZLY-6L智能一體化蒸餾儀（上海那艾精密儀器有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 工藝流程 辣木葉（新鮮、無病蟲）→清洗→烘干→粉碎→浸提→過濾取汁→殺菌（90 ℃，15 min）→冷卻→糖酸調(diào)配→硫處理→加固定化酵母→發(fā)酵→調(diào)配→澄清過濾→殺菌→灌裝→辣木果酒成品。

1. 2. 2 操作步驟

1. 2. 2. 1 辣木基液提取 新鮮辣木葉烘干（60 ℃，12 h）、粉碎，用水（料液比1∶6）于85～90 ℃下浸提25 min，60目過濾即得辣木基液。

1. 2. 2. 2 固定化酵母制備 取0.3%高活性干酵母安琪171#，加入3%蔗糖溶液中，于30 ℃下活化30～60 min，再與0.1%海藻酸鈉溶液混合，加入4%氯化鈣溶液于3～6 ℃低溫下形成凝膠，然后用無菌水沖洗3次，置于3～6 ℃冰箱固化24 h即得固定化酵母。

1. 2. 2. 3 辣木發(fā)酵液制備 取辣木基液于90 ℃殺菌15 min，冷卻調(diào)整糖度，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入焦亞硫酸鈉進(jìn)行硫化抑菌處理。

1. 2. 2. 4 辣木果酒調(diào)配和殺菌 將發(fā)酵好的辣木基酒進(jìn)行糖酸等風(fēng)味調(diào)配，澄清過濾后于90～93 ℃高溫殺菌，灌裝密封。

1. 2. 3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 各試樣中加入100 mg/L焦亞硫酸鈉和固定化酵母后進(jìn)行酒精發(fā)酵，研究不同初始糖度、發(fā)酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發(fā)酵pH對辣木發(fā)酵液殘?zhí)橇亢途凭鹊挠绊憽ＴO(shè)定初始糖度為20%、25%、30%、35%和40%;發(fā)酵溫度為20、23、26、29和32 ℃;焦亞硫酸鈉用量為60、80、100、120和140 mg/L（陳智理等，2010）;pH為3.0、3.5、4.0、4.5和5.0。

1. 2. 4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以初始糖度、發(fā)酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發(fā)酵pH為考察因素進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化固定化酵母發(fā)酵制備辣木果酒的工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1. 2. 5 測定方法 利用手持旋光儀測定殘?zhí)橇浚琾H計(jì)測定pH;按照GB/T 15038—2006酒精計(jì)法測定酒精含量，按照GB/T 15038—2006電位滴定法測定總酸。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行處理，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 初始糖度對固定化酵母發(fā)酵的影響 根據(jù)前期研究的酵母菌用量單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定固定化酵母用量為0.3%，發(fā)酵溫度為26 ℃，研究不同初始糖度對固定化酵母發(fā)酵辣木果酒的影響，結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖1可看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，辣木果酒的殘?zhí)橇棵黠@下降;殘?zhí)橇颗c初始糖度密切相關(guān)，初始糖度越大，殘?zhí)橇恳苍礁撸怯捎谝欢拷湍缚衫玫奶怯邢?。因此，過高的初始糖度不利于辣木果酒徹底發(fā)酵，甚至?xí)?dǎo)致辣木果酒成品過甜而影響感官品質(zhì)。由圖2可知，在一定糖度范圍內(nèi)，隨初始糖度的增加，辣木果酒酒精度也逐漸增加，但初始糖度過高會(huì)影響酵母細(xì)胞的生長和代謝，不利于辣木果酒徹底而持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)酵。當(dāng)初始糖度為30%時(shí)，酒精度達(dá)最高值9.8%（v/v）;初始糖度超過30%后，酒精度呈下降趨勢，其原因可能是高濃度糖的滲透壓抑制了固定化酵母的活性和增殖（高兆建，2005）。因此，初始糖度以選擇25%～30%為宜。

2. 1. 2 發(fā)酵溫度對固定化酵母發(fā)酵的影響 酵母對環(huán)境溫度較敏感，發(fā)酵溫度直接影響固定化酵母的活性和釀造效果。固定化酵母在一定條件下發(fā)酵，不同發(fā)酵溫度對辣木果酒發(fā)酵效果的影響見圖3和圖4。由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度升高，辣木果酒發(fā)酵速度越快、殘?zhí)橇拷档兔黠@。由圖4可知，不同發(fā)酵溫度下辣木果酒的酒精度存在明顯差異。酒精度隨發(fā)酵溫度的升高逐漸上升，發(fā)酵溫度為26 ℃時(shí)酒精度達(dá)最高值9.8%（v/v），之后隨發(fā)酵溫度升高酒精度呈下降趨勢，32 ℃時(shí)酒精度僅為7.2%（v/v），可能是溫度升高時(shí)，固定化酵母的活性反而受到抑制。因此，發(fā)酵溫度選擇26 ℃左右較合適。

2. 1. 3 焦亞硫酸鈉用量對固定化酵母發(fā)酵的影響

焦亞硫酸鈉具有抑菌、抗氧化和澄清作用，常用于果酒發(fā)酵。但其用量須嚴(yán)格控制，用量過多時(shí)，既不符合食品衛(wèi)生和安全要求，又影響果酒的發(fā)酵效率和風(fēng)味品質(zhì)。由圖5和圖6可知，隨著焦亞硫酸鈉用量增多，辣木果酒的殘?zhí)橇恐饾u下降，酒精度上升，當(dāng)焦亞硫酸鈉用量為100 mg/L時(shí)，辣木果酒酒精度達(dá)9.4%（v/v），之后用量越大酒精度反而降低。說明焦亞硫酸鈉用量過大不利于酵母發(fā)酵，可能因?yàn)榻箒喠蛩徕c濃度過高反而抑制酵母活性，影響發(fā)酵效率。因此，辣木果酒發(fā)酵制備選擇焦亞硫酸鈉添加量以80～120 mg/L為宜。

2. 1. 4 發(fā)酵pH對固定化酵母發(fā)酵的影響 酸度（pH環(huán)境）不僅影響各種微生物的生長繁殖，還會(huì)影響酶活力。從圖7可看出，隨著pH增大，辣木果酒的殘?zhí)橇恐饾u降低，pH達(dá)5.0時(shí)，經(jīng)6 d發(fā)酵殘?zhí)橇靠山抵?.4%。從圖8可看出，隨著pH增大，辣木果酒酒精度逐漸升高，當(dāng)pH為4.0時(shí)酒精度達(dá)最高值9.7%（v/v），之后pH增大酒精度反而降低。說明pH過低或過高均不利于酵母發(fā)酵，原因可能是pH過低或過高，環(huán)境的酸堿度均會(huì)抑制酵母活性，影響發(fā)酵效率。故辣木果酒發(fā)酵環(huán)境選擇在pH 3.5～4.5為宜。

2. 2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響固定化酵母發(fā)酵辣木果酒的因素排序?yàn)锽>A>D>C，即發(fā)酵溫度影響最大，初始糖度和發(fā)酵pH次之，焦亞硫酸鈉用量影響最小。最佳組合為A2B3C1D3，即固定化酵母發(fā)酵辣木果酒最佳工藝條件為初始糖度25%、發(fā)酵溫度29 ℃、焦亞硫酸鈉用量80 mg/L、發(fā)酵pH 4.5。

由表3可知，發(fā)酵溫度對固定化酵母發(fā)酵辣木果酒的影響效果顯著（P<0.05），初始糖度、焦亞硫酸鈉用量和發(fā)酵pH的影響均未達(dá)顯著水平（P>0.05）。

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，在最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，辣木果酒酒精度分別為11.7%（v/v）、11.4%（v/v）和11.8%（v/v），平均值11.6%（v/v），高于正交試驗(yàn)中任一組合的結(jié)果，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)結(jié)果的正確性和可重復(fù)性。

3 討論

固定化酵母相對于游離酵母具有發(fā)酵力強(qiáng)、發(fā)酵穩(wěn)定、能連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多種果酒的發(fā)酵生產(chǎn)。本研究所選用的酵母為前期試驗(yàn)篩選出的高活性干酵母安琪171#，該酵母作為固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)辣木果酒的研究鮮見報(bào)道。前期研究進(jìn)行游離酵母與固定化酵母發(fā)酵的試驗(yàn)對比，結(jié)果表明除發(fā)酵初期因固定化酵母細(xì)胞被包埋而發(fā)酵較慢外，后期發(fā)酵速度、持續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定性和產(chǎn)酒率（即酒精度）均優(yōu)于游離酵母，與武運(yùn)等（2008）采用固定化酵母發(fā)酵蟠桃酒、余森艷等（2015）采用固定化酵母釀造臍橙果酒的研究結(jié)果一致。故本研究選用固定化酵母發(fā)酵制備辣木果酒，可較好地保證生產(chǎn)辣木發(fā)酵酒的經(jīng)濟(jì)效率、得酒率和果酒品質(zhì)。

本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察初始糖度、發(fā)酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發(fā)酵pH對固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)辣木果酒酒精度的影響，結(jié)果表明，初始糖度25%、發(fā)酵溫度29 ℃、焦亞硫酸鈉用量80 mg/L和發(fā)酵pH 4.5為最佳發(fā)酵工藝條件，主要影響因素為發(fā)酵溫度，制得的辣木果酒酒精度高達(dá)11.6%（v/v）。研究結(jié)果和各影響因子的變化趨勢與陳智理等（2010）采用固定化酵母發(fā)酵制備香蕉菠蘿復(fù)合果酒、潘嫣麗等（2011）采用固定化酵母發(fā)酵制備雪蓮果—西番蓮復(fù)合果酒的結(jié)果基本相同，如初始糖度基本在20%～25%，pH 4.0～5.0為宜，也是經(jīng)6 d左右時(shí)間發(fā)酵結(jié)束，說明固定化酵母的整體發(fā)酵基本規(guī)律一致。本研究所用抑制雜菌試劑為焦亞硫酸鈉，區(qū)別于亞硫酸氫鈉，其還原性更強(qiáng)、不易氧化損失，而亞硫酸氫鈉具有不愉快味，且易于氧化為硫酸鹽而降低抑菌作用;最適發(fā)酵溫度為29 ℃，略高于陳智理等（2010）、潘嫣麗等（2011）研究的20～25 ℃，可能是辣木基液不同于其他原料，若要提高固定化酵母的發(fā)酵活力，因此需稍高于其他果酒類的發(fā)酵溫度。

與焦家良等（2017）發(fā)酵制得辣木果酒，楊濤（2017）、祝澤英等（2017）經(jīng)酒曲發(fā)酵得到的白酒保健辣木果酒相比，本研究制得的酒體色澤淡黃、清澈穩(wěn)定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，風(fēng)味獨(dú)特;同時(shí)工藝參數(shù)經(jīng)濟(jì)可行，可為規(guī)?；a(chǎn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究制備得到的辣木果酒的呈香呈味、功效成分及功能驗(yàn)證有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

利用固定化酵母在最佳工藝條件下發(fā)酵制得的辣木果酒色澤淡黃、清澈穩(wěn)定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，風(fēng)味獨(dú)特，研究工藝參數(shù)經(jīng)濟(jì)可行，可為規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）