EDTA對(duì)豬肉12-脂肪氧合酶構(gòu)象及酶活力的影響

王晶晶 張新笑 卞歡 耿志明 李鵬鵬 王道營(yíng) 徐為民

摘要：【目的】探究乙二胺四乙酸鈉（EDTA）對(duì)豬肉12-脂肪氧合酶（12-LOX）構(gòu)象和酶活力的影響，為豬肉加工貯藏過程中控制12-LOX活性提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎肊DTA處理豬肉12-LOX，測(cè)定其酶活力，并分析EDTA對(duì)豬肉12-LOX的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、催化亞油酸反應(yīng)、熒光光譜和圓二色譜（Circular dichrosim spectra，CD）的影響?！窘Y(jié)果】添加EDTA可抑制豬肉12-LOX的酶活力，隨EDTA濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)EDTA濃度為10.0 mmol/L時(shí)，豬肉12-LOX活力約下降60%。EDTA能提高豬肉12-LOX的熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性，使其比正常條件下保持較高酶活力。隨著EDTA濃度的增加，豬肉12-LOX分子內(nèi)部的α-螺旋和β-折疊含量降低，引起其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化;豬肉12-LOX的熒光強(qiáng)度不斷減弱，EDTA濃度為20.0 mmol/L時(shí)，酶的內(nèi)源熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降13%，但最大發(fā)射峰（λmax）的位置未發(fā)生變化。【結(jié)論】EDTA能引起豬肉12-LOX的構(gòu)象變化進(jìn)而抑制其酶活力。

關(guān)鍵詞： 豬肉;12-脂肪氧合酶（12-LOX）;乙二胺四乙酸鈉（EDTA）;活力;構(gòu)象

中圖分類號(hào)： S879.2;TS251? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）09-2052-06

Abstract：【Objective】To investigate the effects of sodium ethylene diamite tetracetate（EDTA） on the conformation and enzyme activity of porcine 12-lipoxygenase（12-LOX）， and provide reference for controlling 12-LOX activity during pork processing and storage. 【Method】Porcine 12-LOX was treated with EDTA to determine the enzyme activity of porcine 12-LOX， and the storage stability， thermal stability， catalytic linoleic acid reaction， fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectra（CD） of EDTA effects on porcine 12-LOX were analyzed. 【Result】The results showed that EDTA inhibited the activity of porcine 12-LOX and the inhibitory effect increased with the increasing of EDTA concentration. When the concentration of EDTA was 10.0 mmol/L， the activity of porcine 12-LOX decreased by 60% approximately. The addition of EDTA could increase the thermal stability and storage? stability of porcine 12-LOX and make porcine 12-LOX retain enzyme activity for a longer time than normal conditions. As the concentration of EDTA increased， the content of α-helix and β-sheet inside the porcine 12-LOX molecule decreased， causing obvious change in its secon-dary structure and the fluorescence intensity of porcine 12-LOX was continuously weakened. When the concentration of EDTA was 20.0 mmol/L， the intensity of the endogenous fluorescence emission peak of the enzyme decreased by 13%， but the position of the maximum emission peak（λmax） did not change. 【Conclusion】Collectively， this study indicates that EDTA can cause conformational change of porcine 12-LOX and result in the activity change of porcine 12-LOX， which may providereference for the control of LOX activity during meat processing and storage.

Key words： porcine; 12-lipoxygenase（12-LOX）; sodium ethylene diamite tetracetate（EDTA）; activity; conformation

0 引言

【研究意義】肉制品在加工過程中易發(fā)生脂質(zhì)氧化，影響肉制品風(fēng)味。脂類物質(zhì)的氧化分為自動(dòng)氧化和酶促氧化（張迎陽，2014），脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX）是酶促氧化最主要的內(nèi)源酶，其專一性作用于多不飽和脂肪酸（PUFA）的順，順-1，4-戊二烯基位置，通過分子內(nèi)加氧，生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物。氫過氧化物極不穩(wěn)定，進(jìn)一步反應(yīng)生成多種揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)一方面形成食品的主要風(fēng)味物質(zhì)（郇延軍，2005;Roldan et al.，2014）;另一方面，食品中脂質(zhì)的過度氧化產(chǎn)生刺激性氣味物質(zhì)，不僅引起食品風(fēng)味劣變，還造成PUFA含量下降，導(dǎo)致食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)降低，增加儲(chǔ)藏難度（曹錦軒等，2015;Mashima and Okuyama，2015;Stephany et al.，2015;吳寶森等，2017;Navicha et al.，2017）。因此，研究乙二胺四乙酸鈉（EDTA）對(duì)豬肉中LOX活性的影響，以期在實(shí)際應(yīng)用中控制酶活力，從而使肉制品呈現(xiàn)良好風(fēng)味?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Gata等（1996）從豬的股二頭肌中分離得到一種LOX，研究發(fā)現(xiàn)其可能參與伊比利亞火腿的風(fēng)味形成。Fu等（2009，2015）研究發(fā)現(xiàn)，白鰱魚體內(nèi)的LOX能快速催化降解不飽和脂肪酸，產(chǎn)生與腥味相關(guān)的各種醛類物質(zhì)，從而導(dǎo)致白鰱魚在貯藏和加工過程中出現(xiàn)腥味增強(qiáng)問題。Jin等（2011）的研究結(jié)果表明，LOX在干腌培根加工過程中的脂肪氧化起重要作用，酸度、溫度和鹽含量是影響LOX活性的主要因素。因此，LOX的催化活性和影響因素成為肉品加工的研究熱點(diǎn)。LOX屬于氧化還原酶（閆靜芳等，2013），廣泛存在于動(dòng)植物界中，是一種含非血紅素鐵的雙加氧酶，其金屬輔基的活化態(tài)為氧化性三價(jià)鐵離子，非活化態(tài)為二價(jià)鐵離子。豬肉12-LOX分子量約62 kDa，其X-射線衍射結(jié)果顯示豬肉12-LOX包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即氨基端的PLAT結(jié)構(gòu)域和羧基端的催化結(jié)構(gòu)域（汪曉鳴，2014;張爽，2014）。外源物質(zhì)引入會(huì)導(dǎo)致LOX的構(gòu)象變化從而影響其催化行為。Cai等（2004）研究表明，外源鐵離子以電子傳遞方式與大豆LOX活性中心鐵發(fā)生作用，促進(jìn)酶促反應(yīng)進(jìn)程。蔡燕（2011）、蔡燕等（2015）的研究結(jié)果表明，外源銅離子和鋇離子均能與大豆LOX活性中心鐵離子發(fā)生交換作用，從而抑制催化氧化豆油的反應(yīng)。因此，在肉品加工和貯藏過程中控制和添加某些無機(jī)鹽、有機(jī)電解質(zhì)等物質(zhì)可調(diào)控肉制品LOX活性，從而控制肉品風(fēng)味?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】EDTA是一種金屬離子螯合劑，能與12-LOX活性中心的鐵離子結(jié)合，從而影響12-LOX活力。但目前未見有關(guān)EDTA對(duì)豬肉LOX活性影響的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將EDTA加入到豬肉12-LOX的催化反應(yīng)體系中，觀察外源EDTA對(duì)豬肉12-LOX的催化活性、圓二色譜（Circular dichrosim spectra，CD）和熒光光譜的影響，研究EDTA與豬豬肉12-LOX的相互作用，為豬肉加工貯藏過程中控制12-LOX活性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

豬肉12-LOX為前期課題組制備，亞油酸購自Sigma公司，鹽酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉、EDTA、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純，購自生物工程（南京）股份有限公司。主要設(shè)備儀器：BioTek-Synergy2多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）、M124A分析天平（意大利BEL公司）、HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（普析通用，常州國(guó)華電器有限公司）、MOS-450圓二色譜儀（法國(guó)Biologic公司）、LS-55 Fluorescence Spectrometer（美國(guó)PerkinElmer公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 酶活力測(cè)定

1. 2. 1. 1 底物溶液配制 將0.5 mmoL亞油酸溶于5 mL脫氧重蒸水（含180 μL Tween-20）中，使其充分混勻;逐滴加入1 mol/L氫氧化鈉充分混勻直至體系清澈透明，再用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至9.0，直至亞油酸完全溶解，最后用脫氧重蒸水定容至50 mL。準(zhǔn)備數(shù)支4 mL EP管，將該亞油酸儲(chǔ)備液分裝保存在EP管中，于-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫ê瘟⒊龋?016）。

1. 2. 1. 2 豬肉12-LOX活力測(cè)定 豬肉12-LOX活力測(cè)定方法在Kermasha和Metche（1986）的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)。將20 μL亞油酸底物儲(chǔ)備液與160 μL 50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 5.5）充分混勻，再加入20 μL酶液迅速混勻，于234 nm處測(cè)定其1 min內(nèi)吸光值的增加量。以不加酶液（20 μL亞油酸底物與180 μL檸檬酸緩沖液）為空白。LOX活力定義（Szymanowska et al.，2009）：在一定溫度和pH條件下，反應(yīng)體系在234 nm波長(zhǎng)處吸光值每分鐘增加0.001表示為1個(gè)酶活力單位（U）。

1. 2. 2 EDTA對(duì)豬肉12-LOX活力的影響 按照酶活力測(cè)定方法，在反應(yīng)總體系中加入EDTA溶液，使其終濃度分別為0（空白對(duì)照）、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0 mmol/L，測(cè)定其酶活力，以酶活力最高值為100%，即縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活力。

1. 2. 3 EDTA對(duì)豬肉12-LOX儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響 豬肉12-LOX酶液在4 ℃下儲(chǔ)藏7 d，分別測(cè)定0～7 d的酶活力;另外，在豬肉12-LOX酶液中加入EDTA，相同條件下測(cè)定酶活力，以酶活力最高值為100%。

1. 2. 4 EDTA對(duì)豬肉12-LOX熱穩(wěn)定性的影響 取100 μL豬肉12-LOX酶液在50 ℃水浴中分別水浴0、1、2、3、4、6和8 min，取出后置于冰上，測(cè)酶活力，以0 min的酶活力為100%;在酶液中加入EDTA后，按照上述方法測(cè)定酶活力。

1. 2. 5 EDTA對(duì)豬肉12-LOX催化亞油酸反應(yīng)的影響 在酶活反應(yīng)體系中，加入20 μL EDTA，測(cè)定30 min內(nèi)酶活力的變化。以未加入EDTA的酶活力反應(yīng)體系為對(duì)照。

1. 2. 6 EDTA對(duì)豬肉12-LOX CD光譜的影響 CD光譜能有效分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，常用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定（Kouassi et al.，2007）。以50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.6）為空白對(duì)照，CD光譜的掃描波長(zhǎng)范圍為200～250 nm，光源為氙燈，液池光徑1 mm，在范圍內(nèi)掃描累加3次。掃描速度50 nm/min，豬肉12-LOX酶液濃度0.1 mg/mL。用平均橢圓率[θ]表示CD數(shù)據(jù)，單位為deg·cm2/dmol（Parker and Rees，1960）。

1. 2. 7 EDTA對(duì)豬肉12-LOX熒光光譜的影響 蛋白質(zhì)分子中的芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基團(tuán)具有內(nèi)源熒光性，在一定波長(zhǎng)照射下會(huì)產(chǎn)生熒光，且熒光的產(chǎn)生會(huì)隨著外界條件的改變而變化，因此蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可通過熒光光譜分析（Zhong et al.，2009）。具體方法：在1 mL EP管中加入不同濃度EDTA ，然后加入50 μL豬肉12-LOX酶液（稀釋至0.1 mg/mL），混勻后測(cè)定其在290～450 nm的熒光光譜，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，以50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.6）為空白對(duì)照。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)及發(fā)射光柵狹縫寬5 nm，激發(fā)狹縫寬度設(shè)為3 nm，速率240 nm/min。

2 結(jié)果與分析

2. 1 EDTA對(duì)豬肉12-LOX活力的影響

由圖1可知，隨著EDTA的加入，豬肉12-LOX活力逐漸降低。EDTA濃度較低時(shí)，對(duì)豬肉12-LOX活力影響不明顯，其酶活力基本沒有變化，隨著EDTA濃度的增加，豬肉12-LOX活力快速下降。當(dāng)EDTA濃度為5.0 mmol/L時(shí)，豬肉12-LOX活力降至原來的80%;當(dāng)EDTA濃度為10.0 mmol/L時(shí)，豬肉12-LOX活力已下降至40%左右;而EDTA濃度為20.0 mmol/L時(shí)，LOX完全失去活性。LOX是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，EDTA作為一種金屬離子螯合劑能與鐵離子結(jié)合，從而使豬肉12-LOX活力降低甚至消失。

2. 2 EDTA對(duì)豬肉12-LOX儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響

液態(tài)酶在常溫條件下容易失活，即使在4 ℃下，酶活也不易保持。如圖2所示，豬肉12-LOX在4 ℃下酶活力不穩(wěn)定，儲(chǔ)藏5 d后酶活力喪失30%左右，7 d后酶活力喪失55%左右。在加入EDTA后，豬肉12-LOX活力較穩(wěn)定，儲(chǔ)藏5 d后酶活力喪失20%左右，7 d后酶活力喪失40%左右。可見，EDTA對(duì)豬肉12-LOX的穩(wěn)定性有一定促進(jìn)作用。

2. 3 EDTA對(duì)豬肉12-LOX熱穩(wěn)定性的影響

LOX是一種熱不穩(wěn)定性酶，在受熱條件下易失活。由圖3可知，在50 ℃受熱條件下，豬肉12-LOX的酶活力一直下降，水浴8 min時(shí)酶活力已降至原來的20%左右;在加入EDTA后，水浴8 min時(shí)酶活力下降至原來的30%左右，豬肉12-LOX對(duì)熱變性的抵抗能力有所提高，失活率有所下降，酶活殘余量略有增加。

2. 4 EDTA對(duì)豬肉12-LOX催化亞油酸反應(yīng)的影響

如圖4所示，在0～15 min內(nèi)，兩種反應(yīng)體系中豬肉12-LOX活力均呈逐漸升高趨勢(shì)，其中加入EDTA的反應(yīng)體系中酶活力有所降低。在隨后的反應(yīng)中，加入EDTA的反應(yīng)體系中豬肉12-LOX活力不再升高，達(dá)到反應(yīng)平衡，而未加EDTA的反應(yīng)體系中其酶活力略有升高后達(dá)反應(yīng)平衡，進(jìn)一步證實(shí)EDTA能抑制LOX活力。

2. 5 EDTA對(duì)豬肉12-LOX CD光譜的影響

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要的光活性基團(tuán)是肽鍵，其吸收峰分布在蛋白質(zhì)CD的遠(yuǎn)紫外區(qū)段（190～240 nm），一般α-螺旋特征吸收峰在208和222 nm左右，β-折疊在215 nm左右有一特征吸收負(fù)峰（Greenfield，1996，2006;Li et al.，2013）。如圖5所示，天然狀態(tài)的LOX遠(yuǎn)紫外CD在208和222 nm處顯示負(fù)雙峰曲線，在215 nm處顯示1個(gè)負(fù)肩峰。加入EDTA后，豬肉12-LOX在208、222和215 nm處的特征吸收峰強(qiáng)度下降，表明豬肉12-LOX的ɑ-螺旋和β-折疊含量降低，EDTA的加入使其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且隨EDTA濃度的增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化越明顯。

2. 6 EDTA對(duì)豬肉12-LOX熒光光譜的影響

EDTA的加入會(huì)影響蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境，改變氨基酸中內(nèi)源性熒光生色基團(tuán)的位置和微環(huán)境，從而使其熒光光譜發(fā)生變化，因此可通過內(nèi)源性熒光光譜來檢測(cè)EDTA對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。通過研究EDTA處理對(duì)豬肉12-LOX蛋白熒光性質(zhì)的影響，可得出其構(gòu)象變化信息。EDTA與豬肉12-LOX相互作用后其熒光發(fā)射光譜的變化如圖6所示，隨著EDTA濃度的增加，豬肉12-LOX的熒光強(qiáng)度逐漸降低，在EDTA濃度為20 mmol/L時(shí)，酶的內(nèi)源熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降了13%，但最大發(fā)射峰（λmax）的位置未發(fā)生變化。有研究表明，λmax與色氨酸（Trp）殘基所處微環(huán)境緊密相關(guān)，Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境或外部的極性環(huán)境時(shí)，對(duì)應(yīng)λmax小于330 nm或大于330 nm（Lefevre et al.，2007）。本研究中λmax在340 nm附近，說明其Trp殘基主要分布在蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中。EDTA的加入使豬肉12-LOX在340 nm處的熒光強(qiáng)度降低，說明二者發(fā)生相互作用，導(dǎo)致豬肉12-LOX的內(nèi)源熒光淬滅，但Trp殘基仍處在極性環(huán)境中。

3 討論

EDTA是一種金屬離子螯合物，蔡燕（2011）研究了外源銅離子與鐵離子加入對(duì)LOX酶活體系的影響，沈潔等（2017）研究了EDTA對(duì)大豆LOX活性和催化體系的影響，而本研究探討EDTA加入對(duì)豬肉12-LOX酶活體系的影響。結(jié)果顯示，在豬肉12-LOX酶活體系中加入EDTA后，其酶活力逐漸下降，當(dāng)EDTA濃度為10.0 mmol/L時(shí)，豬肉12-LOX活力約下降60%，是因?yàn)镋DTA與酶活性中心的鐵離子結(jié)合，使酶變?yōu)榉腔钚詰B(tài)，從而酶活力下降。EDTA對(duì)豬肉12-LOX的穩(wěn)定性有一定促進(jìn)作用，加入EDTA 5 d后酶活力喪失約20%，7 d后酶活力喪失40%左右，均比未加EDTA組的酶活性提高10%左右;EDTA也能提高豬肉12-LOX的熱穩(wěn)定性，在50 ℃受熱條件下，水浴8 min時(shí)其活力已下降至原來的20%左右，在加入EDTA后，水浴8 min時(shí)酶活力下降至原來的30%左右，酶活力提高10%，與沈潔等（2017）的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)镋DTA作為一種金屬離子螯合劑，能夠與LOX活性中心的鐵離子結(jié)合，從而使酶活降低，使其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性有所提高。CD光譜結(jié)果表明，EDTA的加入能降低豬肉12-LOX內(nèi)部的α-螺旋和β-折疊含量，引起其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。熒光強(qiáng)度隨著EDTA的加入逐漸降低，在EDTA濃度為20.0 mmol/L時(shí)，酶的內(nèi)源熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降13%，說明EDTA與豬肉12-LOX相互作用引起LOX的內(nèi)源熒光淬滅。這與沈潔等（2017）的研究結(jié)果存在差異，可能是由于酶源及實(shí)驗(yàn)條件的不同所致。

本研究?jī)H添加單一的EDTA，分析其對(duì)豬肉12-LOX活性的影響，下一步將研究其他外源物質(zhì)的加入及EDTA組合對(duì)豬肉12-LOX活性的影響，從而更好地控制肉品加工過程中的LOX活性。

4 結(jié)論

EDTA能抑制豬肉12-LOX活性，降低LOX熒光強(qiáng)度及內(nèi)部α-螺旋和β-折疊含量，引起其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。此研究可為肉制品貯藏和加工過程中LOX的調(diào)控提供參考。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）