擬南芥AtSWEET4基因啟動子序列、編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析及其在病原菌脅迫下表達特性檢測

劉曉柱 李銀鳳

摘要：【目的】分析擬南芥糖運輸載體蛋白基因（AtSWEET4）啟動子序列及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，并檢測病原菌脅迫下AtSWEET4基因的表達特性，為研究AtSWEET4蛋白在擬南芥生長發(fā)育和生物脅迫中的作用機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)方法分析AtSWEET4基因啟動子序列及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）組織染色法檢測人工接種菜豆暈疫病菌（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola，Psp）NPS3121和丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pathovar tomato，Pst）DC3000后AtSWEET4基因的表達情況。【結(jié)果】AtSWEET4蛋白由251個氨基酸組成，分子量為27.8 kD，分子式為C1300H2038N304O346S11，理論等電點（pI）為8.71，脂肪氨基酸指數(shù)為118.76，不穩(wěn)定指數(shù)為38.72，平均親水性指數(shù)為0.629，為穩(wěn)定的親水蛋白，且含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽，為非分泌型蛋白。AtSWEET4蛋白與芥屬的亞麻薺和薺菜SWEET4蛋白親緣關(guān)系最近，其次是十字花科的甘藍和蘿卜SWEET4蛋白，與禾本科的二穗短柄草SWEET4蛋白親緣關(guān)系最遠。AtSWEET4基因啟動子序列中包含核心元件TATA-box、增強子元件CAAT-box、調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)元件、激素響應(yīng)相關(guān)元件、非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件和生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件。Psp NPS3121和Pst DC3000均可誘導(dǎo)AtSWEET4基因表達，但表達模式不同：接種Psp NPS3121后6和12 h的AtSWEET4基因表達明顯上調(diào)，但至接種后24 h又迅速下降;接種Pst DC3000后AtSWEET4基因表達量逐漸增加。【結(jié)論】AtSWEET4基因的啟動子序列特征及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)與其參與植物免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 擬南芥;運輸載體蛋白（SWEET4）;理化性質(zhì);結(jié)構(gòu)特征;啟動子序列;病原菌脅迫;表達分析

中圖分類號： S432.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A? ? ? ?文章編號：2095-1191（2019）09-1893-10

Abstract：【Objective】To provide theory basis for AtSWEET4 protein in regulating plant development and pathogensstress in Arabidopsis thaliana，the protein structural features and promoter sequence characteristics of A. thaliana sugars will eventually be exported transporters gene（AtSWEET4） were analyzed，expression pattern of AtSWEET4 were detected under pathogens stress conditions. 【Method】The sequence characteristics of AtSWEET4 gene promoter and structural features of its encoded protein were analyzed using bioinformatics methods. In addition，the expression of AtSWEET4 gene were also explored via real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） after inoculation of Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola（Psp） and Pseudomonas syringae pathovar tomato（Pst） DC3000 by beta glucuronidase tissue staining methods. 【Result】Sequence analysis demonstrated that AtSWEET4 protein was consistent of 251 amino acids， the molecular weight of AtSWEET4 was 27.8 kD， molecular formula was C1300H2038N304O346S11，and the isoelectric point（pI） was 8.71. Fatty amino acid index was 118.76， instability index 38.72，average hydrophilicity index was 0.629， which was a hydrophilic protein.It contained seven transmembrane domains， had no signal peptide and belonged to non secretion type protein. AtSWEET4 protein had the nearest relationship with SWEET4 protein of Camelina sativa and shepherd’s-purse in Brassica， followed by that of wild cabbage and carrot in Cruciferae， it had the? farthest relationship with that of Brachypodium distachyon in Gramineae. AtSWEET4 promoter sequence contained core element TATA-box，enhancer element CAAT-box， plant growth and development related elements，hormone response related elements，abiotic stress response related elementsand biotic stress response related elements. PspNPS3121 and Pst DC3000 could induce expression of AtSWEET4 gene， but with different expression patterns. AtSWEET4 gene up-regulated 6 and 12 h after inoculation with PspNPS3121， but down-regulated after 24 h quickly. Expression of AtSWEET4 gene gradually increased after inoculation with Pst DC3000. 【Conclusion】The promoter sequence characteristics of AtSWEET4 and its encoded protein structural features are closed related to their defense function to plant immunity.

Key words： Arabidopsis thaliana; transport carrier protein（AtSWEET4）; physicochemical property; structure features; promoter sequence; pathogens stress; expression analysis

0 引言

【研究意義】植物光合作用的主要產(chǎn)物，如蔗糖、葡萄糖和果糖等參與調(diào)控植物的多種生命活動，其跨生物膜系統(tǒng)運輸時需要相應(yīng)的蛋白質(zhì)載體協(xié)助，如單糖轉(zhuǎn)運蛋白、蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖外排轉(zhuǎn)運蛋白等（Slewinski，2011;Lahmidi et al.，2016）。其中，糖運輸載體（Sugars will eventually be exported transporters，SWEETs）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類新型糖運輸?shù)鞍准易?，參與調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)（Li et al.，2018）。因此，分析擬南芥糖運輸載體蛋白（AtSWEET4）基因及其啟動子序列特征，檢測病原菌脅迫下AtSWEET4基因表達特性，可為研究AtSWEET4基因在擬南芥生長發(fā)育和逆境脅迫中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】目前，主要利用模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）研究SWEETs基因家族功能（韓佳軒和姜晶，2015），但近年來在其他物種中也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)、克隆及表達（玄元虎等，2014;胡麗萍等，2017;Gao et al.，2018）。在植物體內(nèi)SWEETs蛋白負責(zé)糖類物質(zhì)的運輸、再分配及貯藏等，從而調(diào)控植物多種生命活動。其中，水稻OsSWEET11是一種蔗糖低親和型運輸載體，參與蔗糖在水稻韌皮部裝載的過程（Yuan and Wang，2013），且在OsSWEET5基因過表達植株中，葉片中可溶性糖和吲哚乙酸（IAA）的含量發(fā)生變化會導(dǎo)致幼苗期植株生長延遲和早衰（Zhou et al.，2014）;葡萄VvSWEET4、VvSWEET7、VvSWEET10、VvSWEET11、VvSWEET15和VvSWEET17d等6個SWEETs基因家族成員在其漿果發(fā)育過程中表達量顯著提高（Chong et al.，2014）;蕪菁BrSWEET9突變體中，BrSWEET9基因的表達被抑制，植株中花蜜分泌量顯著減少（Lin et al.，2014）;大豆中大多數(shù)SWEETs基因家族成員均在種子中表達，且隨著種子灌漿期的發(fā)育其表達量逐漸提高，種子成熟后其表達量又逐漸下降（Patil et al.，2015）;擬南芥atsweet8突變體植株四分體時期的小孢子因無法正常沉積孢粉素，而導(dǎo)致花粉外壁發(fā)育缺陷，植株雄配子育性降低（Guan et al.，2008）。此外，SWEETs參與植物的生物逆境脅迫反應(yīng)，當細菌、真菌等植物病原菌入侵植物后，可導(dǎo)致植物SWEETs基因表達上調(diào)，使糖類物質(zhì)從植物細胞進入病原菌細胞中，從而使其大量繁殖（Chandran，2015），如水稻感染白葉枯病菌后，白葉枯病菌分泌的特定轉(zhuǎn)錄激活（TAL）效應(yīng)因子能結(jié)合在特定OsSWEETs基因的啟動子區(qū)域，從而激活目標OsSWEETs基因的表達，促使更多糖類從植株細胞中進入病原菌中，促進病原菌增殖，導(dǎo)致植株感?。↙i et al.，2013;Hu et al.，2014）?？梢?，SWEETs基因家族成員在宿主和病原菌互作過程中發(fā)揮重要作用。【本研究切入點】本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtSWEET4蛋白介導(dǎo)葡萄糖和果糖的運輸，影響植物的生長發(fā)育過程（Liu et al.，2016），但目前關(guān)于AtSWEET4基因啟動子序列特征及其表達對植物的抗性影響機制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用生物信息學(xué)方法分析AtSWEET4基因啟動子序列及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）組織染色法檢測人工接種病原菌后AtSWEET4基因的表達情況，為研究AtSWEET4蛋白在擬南芥生長發(fā)育和生物脅迫中的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試擬南芥品種為Col-0生態(tài)型。擬南芥種子在冰箱內(nèi)4 ℃春化2 d后播種于植物營養(yǎng)基質(zhì)中（營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1），22 ℃，12 h/12 h光照/黑暗恒溫培養(yǎng)。菜豆暈疫病菌（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola，Psp）NPS3121和丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pathovar tomato，Pst） DC3000由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細胞生物學(xué)實驗室提供。主要試劑：大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞、植物基因組DNA提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、M-Mulv逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 AtSWEET4基因啟動子序列及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 從擬南芥信息資源庫（The Arabidopsis Information Resource，TAIR）中下載獲取擬南芥SWEET4基因（AT3G28007）編碼區(qū)及其編碼的氨基酸序列和起始密碼子ATG上游2000 bp的啟動子序列。采用瑞士生物信息學(xué)研究中心蛋白質(zhì)專業(yè)分析系統(tǒng)（http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html）、國際生物測量學(xué)與進化生物學(xué)實驗室在線系統(tǒng)（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_dsc.html）和ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）等在線工具分析AtSWEET4蛋白的理化性質(zhì)。采用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、PRABI-Lyon-Gerland（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=/NPSA/npsa_dsc.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/repository）等在線工具分析AtSWEET4蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)特征;以MEAG 7.0構(gòu)建AtSWEET4蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹;運用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、NEW PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）和MethPrimer 2.0（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）等在線工具分析AtSWEET4基因的啟動子序列特征。

1. 2. 2 植物表達載體構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

1. 2. 2. 1 AtSWEET4基因啟動子克隆及植物表達載體pBI121-psweet4：：GUS構(gòu)建 采用植物基因組試劑盒提取擬南芥基因組DNA。利用提取的基因組DNA、擬南芥SWEET4基因啟動子引物pSWEET4-F和pSWEET4-1391R（表1）進行SWEET4基因啟動子序列PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，DNA模板2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（pSWEET4-F和pSWEET4-1391R）各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶5 U，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并切膠回收，經(jīng)Pst I和Nco I酶切后與載體pBI121連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞中，通過酶切驗證后挑取陽性重組植物表達載體，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 2. 2. 2 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 利用凍融法將構(gòu)建的重組植物表達載體pBI121-psweet4：：GUS轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。通過花絮侵染法，利用攜帶重組載體pBI121-psweet4：：GUS的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化Col-0生態(tài)型擬南芥，繼續(xù)培養(yǎng)擬南芥植株，待其種子成熟后收取種子，通過卡納霉素抗性篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1. 2. 3 轉(zhuǎn)基因植株檢測 用卡納霉素篩選出抗性植株，并提取其基因組DNA，以GUS-R和GUS-R（表1）為引物進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，DNA模板1.0 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（GUS-F和GUS-R）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶3 U，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。設(shè)野生型Col-0葉片DNA為模板的PCR反應(yīng)體系為對照（CK）。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 2. 4 病原菌接種 采用KBM液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)Psp NPS3121和Pst DC3000，培養(yǎng)條件為28 ℃，200 r/min。待菌液培養(yǎng)至OD600 nm為1.0時，4000 r/min離心2 min收集菌體，10 mmol/L MgCl2溶液洗滌菌體，并用10 mmol/L MgCl2溶液懸浮菌體至OD600 nm為0.2（×108 CFU/mL），加入Silwet L-77，使其終體積為0.2%。選取約3周齡生長健壯的擬南芥植株，采集其完全伸展開的葉片用于真空滲透接種，將菌體注入葉片后，擦拭多余的菌液。接種后0、6、12和24 h分別取大小一致的葉片各3片，液氮迅速冷凍后-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 5 qRT-PCR檢測AtSWEET4基因表達情況 參照植物總RNA提取試劑盒說明提取擬南芥葉片RNA，并利用M-Mulv逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于qRT-PCR檢測AtSWEET4基因在3周齡擬南芥Col-0葉片接種非寄主菌Psp NPS3121后，具體操作參照SYBR Green Mix說明，所用引物序列（SWEET4-F和SWEET4-R）見表1。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理和作圖，使用Photoshop CS 6.0輔助制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 AtSWEET4蛋白氨基酸序列及其理化性質(zhì)分析結(jié)果

AtSWEET4基因序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtSWEET4基因編碼區(qū)全長756 bp，編碼251個氨基酸。AtSWEET4蛋白分子量為27.8 kD，分子式為C1300H2038N304O346S11，理論等電點（pI）為8.71，脂肪氨基酸指數(shù)為118.76;不穩(wěn)定指數(shù)為38.72，屬于穩(wěn)定蛋白。AtSWEET4蛋白中以亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸和蘇氨酸含量較高，分別為12.4%、10.4%、8.8%、6.8%、6.4%、6.4%、6.4%和6.0%;其中，負電荷氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）數(shù)量為16個（6.4%），正電荷氨基酸殘基（精氨酸和賴氨酸）數(shù)量為20個（8.0%），輸水氨基酸（丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸）數(shù)量為115個（45.8%），極性氨基酸（半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸）數(shù)量為67個（26.7%）。

采用ProtScale預(yù)測AtSWEET4蛋白親/疏水特性，結(jié)果如圖1所示。該蛋白的最大親水位點為第223位的天冬氨酸（D），分值為-3.544，最大疏水位點為第138位的半胱氨酸（C），分值為3.256，平均親水性指數(shù)為0.629，即AtSWEET4蛋白屬于親水蛋白。

采用DNAMAN將AtSWEET4蛋白氨基酸序列與其他物種的SWEET4蛋白進行多重比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtSWEET4蛋白的氨基酸序列與亞麻芥（Camelina sativa）CsSWEET4、甘藍（Brassica oleracea）BoSWEET4、蘿卜（Raphanus sativus）RsSWEET4、苧麻（Brassica napus）BnSWEET4和煙草（Nicotiana tabacum）NtSWEET4的氨基酸序列相似性均超過70%（圖2）。

2. 2 擬南芥AtSWEET4蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

DNAMAN多重比對分析結(jié)果顯示，AtSWEET4蛋白與CsSWEET4、BoSWEET4、RsSWEET4、BnSWEET4和NtSWEET4均包含7個典型的跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）序列（圖2）;采用TMHMM Server v. 2.0預(yù)測結(jié)果也顯示AtSWEET4含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3）。SignalP 4.1 Server預(yù)測結(jié)果顯示，AtSWEET4蛋白無信號肽切割位點，表明其無信號肽，為非分泌型蛋白（圖4）。AtSWEET4蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖5所示，AtSWEET4蛋白二級結(jié)構(gòu)中含α-螺旋數(shù)量最多，為122個（48.61%），無規(guī)則卷曲113個（45.02%），β-折疊16個（6.37%）。利用SWISS-MODEL預(yù)測AtSWEET4蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-螺旋和無規(guī)則卷曲為該蛋白三級結(jié)構(gòu)的主要成分（圖6），與其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果吻合。

從GenBank下載不同物種SWEET4蛋白的氨基酸序列，并采用MEAG 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖7所示。AtSWEET4蛋白與芥屬的亞麻薺和薺菜（Capsella rubella）SWEET4蛋白親緣關(guān)系最近，與十字花科的甘藍和蘿卜SWEET4蛋白親緣關(guān)系較近，與禾本科的二穗短柄草（Brachypodium distachyon）SWEET4蛋白親緣關(guān)系最遠。此外，同科物種的SWEET4蛋白親緣關(guān)系較近，如茄科的煙草（Nicotinana attenuate）和辣椒（Capsicum chinense）SWEET4蛋白處在同一分支，禾本科的水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、糜子（Panicum miliaceum）、小麥（Triticum urartu）、玉米（Zea mays）和谷子（Setaria italica）SWEET4等處在同一分支，表明植物SWEET4蛋白在進化過程中相對較保守。

2. 3 AtSWEET4基因啟動子序列分析結(jié)果

利用PlantCARE和NEW PLACE分析AtSWEET4基因啟動子序列，結(jié)果如表2所示。該基因啟動子序列中包含核心元件TATA-box、增強子元件CAAT-box、調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)元件（MYB recognition site、MYB-binding site、T-box promoter motif、LFY consensus binding site motif、CCA1 binding site motif和I box promoter motif等）、組織特異性相關(guān)元件（GATA-box等）、激素響應(yīng)相關(guān)元件（茉莉酸反應(yīng)相關(guān)元件TGACG-motif、乙烯響應(yīng)相關(guān)元件ERE、ABA信號途徑ATHB5 binding site motif和生長素信號途徑ARF binding site motif等）、非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件（厭氧誘導(dǎo)必要順式作用元件ARE和低溫反應(yīng)相關(guān)元件LTR等）和生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件（真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件W box）。

此外，采用Methprimer 2.0預(yù)測AtSWEET4基因啟動CpG島，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在擬南芥AtSWEET4基因啟動子中無CpG島存在（圖8），說明AtSWEET4基因未發(fā)生甲基化修飾和調(diào)控。

2. 4 重組植物表達載體pBI121-psweet4：：GUS構(gòu)建及純合轉(zhuǎn)基因植株獲得

以擬南芥基因組DNA為模板，利用引物pSWEET4-F和pSWEET4-1391R進行PCR擴增，獲得約2000 bp特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖9）。將其連接至表達載體pBI121上構(gòu)建重組植物表達載體pBI121-psweet4：：GUS，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0，通過卡納霉素篩選，獲得4株抗性植株，對其進行PCR檢測，結(jié)果從4株抗性植株中均可擴增出約1500 bp特異性條帶，而CK未檢測出該條帶（圖10），表明篩選出的4株抗性植株均為轉(zhuǎn)psweet4：：GUS擬南芥植株。

2. 5 接種病原菌后AtSWEET4基因表達情況

采用qRT-PCR檢測AtSWEET4基因在接種非寄主菌Psp NPS3121的擬南芥Col-0葉片中表達情況，結(jié)果如圖11-A所示。接種Psp NPS3121可誘導(dǎo)AtSWEET4基因的表達，其中，接種后6和12 h的相對表達量約是接種前（0 h）表達量的7倍，接種后24 h的相對表達量又降至較低水平。為進一步證實該結(jié)果，轉(zhuǎn)psweet4：：GUS基因擬南芥植株接種Psp NPS3121，結(jié)果（圖11-B）發(fā)現(xiàn)，接種6和12 h后植株葉片中GUS著色較深，說明AtSWEET4基因表達較強，而接種24 h后GUS著色較淺，暗示AtSWEET4基因的表達水平較弱。

采用qRT-PCR檢測AtSWEET4基因在3周齡擬南芥Col-0葉片接種寄主菌Pst DC3000后的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種Pst DC3000后，AtSWEET4基因的相對表達量不斷升高（圖12），說明Pst DC3000可誘導(dǎo)AtSWEET4基因的表達。

3 討論

植物SWEETs蛋白屬于MtN3/saliva家族，由7個跨膜結(jié)構(gòu)域組成，其中前3個以TM1-TM3-TM2的形式排列，第4個跨膜結(jié)構(gòu)域保守性較差，主要發(fā)揮連接作用，因此，形成3-1-3結(jié)構(gòu)形式（Forrest et al.，2011;Xuan et al.，2013）。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsSWEET2b蛋白N端由TM4與THB1構(gòu)成，C端由THB2構(gòu)成（Tao et al.，2015）;OsSWEET2蛋白中發(fā)揮葡萄糖運轉(zhuǎn)功能的關(guān)鍵位點分別為TM2的半胱氨酸、TM3和TM7的天冬酰胺及TM6的苯丙氨酸（Tao et al.，2015）。雖然前人研究已證實AtSWEET4蛋白在擬南芥的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用（Liu et al.，2016），但AtSWEET4蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征尚不清楚，為此，本研究采用生物信息學(xué)方法分析AtSWEET4蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AtSWEET4蛋白分子量為27.8 kD，理論等電點為8.71，分子式為C1300H2038N304O346S11，脂肪氨基酸指數(shù)為118.76，不穩(wěn)定指數(shù)為38.72，屬于穩(wěn)定蛋白和親水蛋白，無信號肽，含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，其蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)中以α-螺旋最多（48.61%），其次是無規(guī)則卷曲（45.02%），表明AtSWEET4蛋白具有SWEET蛋白家族典型結(jié)構(gòu)特征，但其分子結(jié)構(gòu)還需借助電鏡作進一步研究。

病原菌可誘導(dǎo)多種植物SWEETs基因成員的表達，如辣椒SWEET基因（UPA16）可被細菌性瘡痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）誘導(dǎo)表達（Kay et al.，2009）;小麥SWEET基因可被條銹病菌（Puccinia striiformis）誘導(dǎo)表達（Slewinski，2011）;木薯MeSWEET10a基因可被細菌性枯萎病（X. axonopodis pv. manihotis）的TAL20效應(yīng)因子誘導(dǎo)表達（Cohn et al.，2014）;甜橙CsSWEET1基因可被細菌性潰瘍病（X. citris sp. citri）的PthA4和PthAw效應(yīng)因子誘導(dǎo)表達（Hu et al.，2014）;葡萄VvSWEET4基因參與調(diào)控灰霉病病原菌（Botrytis cinerea）的抗性（Chong et al.，2014）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AtSWEET4基因表達上調(diào)，導(dǎo)致擬南芥對Psp NPS3121抗性降低（Liu et al.，2016）。本研究AtSWEET4基因啟動子序列分析結(jié)果也顯示，AtSWEET4基因啟動子中存在病原菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件，因此，采用qRT-PCR和GUS組織染色法檢測接種病原菌后AtSWEET4基因的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Psp NPS3121和Pst DC3000均可誘導(dǎo)AtSWEET4基因表達，但表達模式不同：接種Psp NPS3121后6和12 h的AtSWEET4基因表達明顯上調(diào)，但至接種后24 h又迅速下降;接種Pst DC3000后，AtSWEET4基因表達量逐漸增加。二者表達模式的差異可能與病原菌的致病模式有關(guān)，Psp NPS3121屬于擬南芥非寄主菌，侵染擬南芥后植株通過自身免疫系統(tǒng)抑制病原菌，導(dǎo)致AtSWEET4基因在接種后6和12 h呈上調(diào)表達，但接種24 h后AtSWEET4基因表達下調(diào);Pst DC3000屬于擬南芥的寄主菌，具有對抗植物免疫系統(tǒng)的效應(yīng)因子，侵染擬南芥后可持續(xù)誘導(dǎo)AtSWEET4基因表達，為植株提供更多的糖分以抵抗病原菌侵染。

植物SWEETs家族蛋白不僅能為植物病原菌提供糖類物質(zhì)，還可為有益微生物提供營養(yǎng)，如根瘤菌可誘導(dǎo)苜蓿MtSWEET11基因的表達，在形成共生根瘤形成時為其提供糖類物質(zhì)（Kryvoruchko et al.，2016），說明SWEETs蛋白家族在植物與微生物的互作中發(fā)揮重要作用。但目前對該家族蛋白的研究尚處于起始階段，其具體功能機理還需深入研究。

4 結(jié)論

AtSWEET4蛋白結(jié)構(gòu)特征和啟動子序列特征與其參與植物免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）